Limitări, pericole și complicații ale transplantului de celule

Medicina plastică regenerativă se bazează pe implementarea clinică a proprietăților toti- și pluripotente ale celulelor stem embrionare și progenitoare, care permit in vitro și in vivo crearea unor linii celulare specifice ce repopulează țesuturile și organele deteriorate ale unei persoane bolnave.

Posibilitatea reală de a utiliza celule stem embrionare și celule stem din țesuturi definitive (așa-numitele celule stem „adulte”) umane în scopuri terapeutice nu mai este pusă la îndoială. Cu toate acestea, experții de la Academiile Naționale și Medicale din SUA (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press) și Institutul Național de Sănătate din SUA (Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA) recomandă un studiu mai detaliat al proprietăților celulelor stem în experimente pe modele biologice adecvate și o evaluare obiectivă a tuturor consecințelor transplantului, și abia apoi utilizarea celulelor stem în clinică.

S-a stabilit că celulele stem fac parte din derivatele tisulare ale tuturor celor trei straturi germinale. Celulele stem se găsesc în retină, cornee, epidermă, măduvă osoasă și sânge periferic, în vasele de sânge, pulpa dentară, rinichi, epiteliu gastrointestinal, pancreas și ficat. Folosind metode moderne, s-a dovedit că celulele stem neuronale sunt localizate în creierul și măduva spinării unui adult. Aceste date senzaționale au atras o atenție deosebită din partea oamenilor de știință și a mass-media, deoarece neuronii din creier au servit drept exemplu clasic de populație celulară statică care nu se restabilește. Atât în perioadele timpurii, cât și în cele târzii ale ontogenezei, neuronii, astrocitele și oligodendrocitele se formează în creierul animalelor și al oamenilor datorită celulelor stem neuronale (Celule stem: progres științific și direcții viitoare de cercetare. Institutul Național de Sănătate al SUA).

Cu toate acestea, în condiții normale, plasticitatea celulelor stem din țesuturile definitive nu se manifestă. Pentru a realiza potențialul plastic al celulelor stem din țesuturile definitive, acestea trebuie izolate și apoi cultivate în medii cu citokine (LIF, EGF, FGF). Mai mult, derivații de celule stem se grefează cu succes doar atunci când sunt transplantați în corpul unui animal cu un sistem imunitar deprimat (iradiere gamma, citostatice, busulfan etc.). Până în prezent, nu s-au obținut dovezi convingătoare privind implementarea plasticității celulelor stem la animale care nu au fost expuse la radiații sau la alte efecte care provoacă imunosupresie profundă.

În astfel de condiții, potențialul periculos al ESC-urilor se manifestă, în primul rând, în timpul transplantării lor în zone ectopice - în timpul injectării subcutanate a ESC la șoareci imunodeficienți, la locul injectării se formează teratocarcinoame. În plus, în timpul dezvoltării embrionului uman, frecvența anomaliilor cromozomiale este mai mare decât în embriogeneza la animale. În stadiul de blastocist, doar 20-25% dintre embrionii umani sunt constați din celule cu cariotip normal, iar marea majoritate a embrionilor umani timpurii obținuți după fertilizarea in vitro prezintă mozaicism cromozomial haotic și se confruntă foarte des cu aberații numerice și structurale.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Efectele benefice ale celulelor stem

Rezultatele preliminare ale studiilor clinice confirmă efectul benefic al celulelor stem asupra pacientului, dar încă nu există informații despre efectele pe termen lung ale transplantului de celule. Literatura de specialitate a fost inițial dominată de rapoarte despre rezultatele pozitive ale transplantului de fragmente de creier embrionar în boala Parkinson, dar apoi au început să apară date care neagă efectul terapeutic eficient al țesutului nervos embrionar sau fetal transplantat în creierul pacienților.

La mijlocul secolului al XX-lea, a fost descoperită pentru prima dată restabilirea hematopoiezei la animalele iradiate letal după transfuzia intravenoasă de celule de măduvă osoasă, iar în 1969, cercetătorul american D. Thomas a efectuat primul transplant de măduvă osoasă la om. Lipsa de cunoștințe despre mecanismele de incompatibilitate imunologică dintre celulele de măduvă osoasă donator și receptor la acea vreme a dus la o mortalitate ridicată din cauza eșecului frecvent al transplantului și a dezvoltării reacției grefă-contra-gazdă. Descoperirea complexului major de histocompatibilitate, care include antigenele leucocitare umane (HbA1c), și îmbunătățirea metodelor de tipizare a acestora au făcut posibilă creșterea semnificativă a supraviețuirii după transplantul de măduvă osoasă, ceea ce a dus la utilizarea pe scară largă a acestei metode de tratament în oncohematologie. Un deceniu mai târziu, au fost efectuate primele transplanturi de celule stem hematopoietice (HSC) obținute din sângele periferic prin leucafereză. În 1988, sângele din cordonul ombilical a fost utilizat pentru prima dată ca sursă de HSC-uri în Franța pentru a trata un copil cu anemie Fanconi, iar de la sfârșitul anului 2000, în presă au apărut rapoarte despre capacitatea HSC-urilor de a se diferenția în celule de diferite tipuri de țesuturi, ceea ce extinde potențial domeniul de aplicare clinic al acestora. Cu toate acestea, s-a dovedit că materialul de transplant, împreună cu HSC-urile, conține un număr semnificativ de impurități celulare non-hematopoietice de diferite naturi și proprietăți. În acest sens, se dezvoltă metode de purificare a transplantului și criterii pentru evaluarea purității sale celulare. În special, se utilizează imunoselecția pozitivă a celulelor CD34+, care permite izolarea HSC-urilor folosind anticorpi monoclonali.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ], [ 12 ]

Complicațiile terapiei cu celule stem

Complicațiile transplantului de măduvă osoasă sunt cel mai adesea hematologice și asociate cu o perioadă lungă de pancitopenie iatrogenă. Cel mai des se dezvoltă complicații infecțioase, anemia și hemoragiile. În acest sens, este extrem de important să se selecteze modul optim de colectare, procesare și depozitare a măduvei osoase pentru conservarea maximă a celulelor stem, ceea ce va asigura o restaurare rapidă și stabilă a hematopoiezei. La caracterizarea unui transplant, în prezent se evaluează în mod obișnuit următorii parametri: numărul de celule mononucleare și/sau nucleate, unitățile formatoare de colonii și conținutul de celule CD34-pozitive. Din păcate, acești indicatori oferă doar o evaluare indirectă a capacității hematopoietice reale a populației de celule stem din transplant. Astăzi, nu există parametri absolut exacți pentru a determina suficiența unui transplant pentru restaurarea pe termen lung a hematopoiezei la pacienți, chiar și cu transplant autolog de măduvă osoasă. Elaborarea unor criterii generale este extrem de dificilă din cauza lipsei unor standarde stricte pentru procesarea, crioconservarea și testarea transplantului. În plus, este necesar să se ia în considerare întreaga varietate de factori care influențează parametrii restaurării cu succes a hematopoiezei la fiecare pacient în parte. În transplantul autolog de măduvă osoasă, cei mai importanți dintre aceștia sunt numărul de cure anterioare de chimioterapie, caracteristicile regimului de condiționare, perioada bolii în care a fost recoltată măduva osoasă și schemele de utilizare a factorilor de stimulare a coloniilor în perioada post-transplant. În plus, nu trebuie uitat faptul că chimioterapia care precede recoltarea transplantului poate avea un efect negativ asupra celulelor stem din măduva osoasă.

Incidența complicațiilor toxice severe crește semnificativ în timpul transplantului alogen de măduvă osoasă. În acest sens, datele statistice privind transplantul alogen de măduvă osoasă în talasemie prezintă interes. Rapoartele Grupului European de Transplant de Măduvă Osoasă au înregistrat aproximativ 800 de transplanturi de măduvă osoasă la pacienți cu talasemie majoră. Transplantul alogen în talasemie se efectuează în marea majoritate a cazurilor de la frați/surori HLA-identici, ceea ce se asociază cu complicații severe și mortalitate ridicată în timpul transplantului de material celular stem de la donatori înrudiți parțial compatibili sau neînrudiți compatibili. Pentru a minimiza riscul complicațiilor infecțioase fatale, pacienții sunt plasați în cutii aseptice izolate cu flux laminar de aer și primesc o dietă cu conținut scăzut sau abacterian. Pentru decontaminarea bacteriană a intestinului, se prescriu per os forme neresorbabile de antibiotice și medicamente antifungice. Pentru profilaxie, se administrează amfotericină B intravenos. Prevenirea infecțiilor sistemice este întărită cu amikacină și ceftazidimă, care se prescriu cu o zi înainte de transplant, continuând tratamentul până la externarea pacientului. Toate produsele sanguine sunt iradiate cu o doză de 30 Gy înainte de transfuzie. Nutriția parenterală în timpul transplantului este o condiție necesară și începe imediat după restricționarea aportului alimentar pe cale naturală.

O serie de complicații sunt asociate cu toxicitatea ridicată a medicamentelor imunosupresoare, care provoacă adesea greață, vărsături și mucozită, leziuni renale și pneumonie interstițială. Una dintre cele mai severe complicații ale chimioterapiei este boala veno-ocluzivă a ficatului, care duce la deces în perioada post-transplant timpuriu. Factorii de risc pentru tromboza venelor sistemului portal hepatic includ vârsta pacienților, prezența hepatitei și a fibrozei hepatice, precum și terapia imunosupresoare după transplantul de măduvă osoasă. Boala veno-ocluzivă este deosebit de periculoasă în talasemie, care este însoțită de hemosideroză hepatică, hepatită și fibroză - însoțitori frecvenți ai terapiei transfuzionale. Tromboza venelor sistemului portal hepatic se dezvoltă la 1-2 săptămâni după transplant și se caracterizează printr-o creștere rapidă a conținutului de bilirubină și a activității transaminazelor în sânge, progresia hepatomegaliei, ascită, encefalopatie și durere în abdomenul superior. Histologic, materialul autoptic relevă leziuni endoteliale, hemoragii subendoteliale, leziuni ale hepatocitelor centrolobulare, obstrucție trombotică a venulelor și venelor centrale ale ficatului. La pacienții cu talasemie au fost descrise cazuri de stop cardiac fatal asociate cu efectele toxice ale citostaticelor.

În perioada pre-transplant, ciclofosfamida și busulfanul provoacă adesea cistită toxico-hemoragică cu modificări patologice ale celulelor uroepiteliale. Utilizarea ciclosporinei A în transplantul de măduvă osoasă este adesea însoțită de nefro- și neurotoxicitate, sindrom de hipertensiune arterială, retenție de lichide în organism și citoliză hepatocitară. Disfuncția sexuală și reproductivă este mai des observată la femei. La copiii mici, dezvoltarea pubertară nu este de obicei afectată după transplant, dar la copiii mai mari, patologia dezvoltării sferei sexuale poate fi foarte gravă - până la sterilitate. Complicațiile direct legate de transplantul în sine includ respingerea celulelor alogene ale măduvei osoase, incompatibilitatea ABO, formele acute și cronice de boală grefă-contra-gazdă.

La pacienții cu transplant de măduvă osoasă incompatibil cu ABO, izoaglutininele gazdă versus donator ABO sunt produse timp de 330-605 zile după transplant, ceea ce poate duce la hemoliză prelungită și poate crește dramatic nevoia de transfuzii de sânge. Această complicație este prevenită prin transfuzarea doar a globulelor roșii de tip 0. După transplant, unii pacienți prezintă neutropenie autoimună, trombocitopenie sau pancitopenie, care necesită splenectomie pentru corectare.

La 35-40% dintre receptori, boala grefă-contra-gazdă acută se dezvoltă în decurs de 100 de zile după transplantul alogen de măduvă osoasă HLA-identic. Gradul de afectare a pielii, ficatului și intestinului variază de la erupții cutanate, diaree și hiperbilirubinemie moderată până la descuamare a pielii, obstrucție intestinală și insuficiență hepatică acută. La pacienții cu talasemie, incidența bolii grefă-contra-gazdă acute de gradul I după transplantul de măduvă osoasă este de 75%, iar gradul II și superior este de 11-53%. Boala grefă-contra-gazdă cronică, ca sindrom sistemic multiplu de organe, se dezvoltă de obicei în decurs de 100-500 de zile după transplantul alogen de măduvă osoasă la 30-50% dintre pacienți. Sunt afectate pielea, cavitatea bucală, ficatul, ochii, esofagul și tractul respirator superior. Se face distincție între o formă limitată de boală grefă-contra-gazdă cronică, când pielea și/sau ficatul sunt afectate, și o formă răspândită, când leziunile cutanate generalizate sunt combinate cu hepatită cronică agresivă, leziuni ale ochilor, glandelor salivare sau oricărui alt organ. Decesul este adesea cauzat de complicații infecțioase rezultate din imunodeficiența severă. În talasemie, o formă ușoară de boală cronică grefă-contra-gazdă apare la 12%, o formă moderată la 3% și o formă severă la 0,9% dintre receptorii de măduvă osoasă alogenă HLA compatibilă. O complicație severă a transplantului de măduvă osoasă este rejetul grefei, care se dezvoltă la 50-130 de zile după intervenția chirurgicală. Frecvența rejetului depinde de regimul de condiționare. În special, la pacienții cu talasemie care au primit doar metotrexat în perioada de pregătire, rejetul transplantului de măduvă osoasă a fost observat în 26% din cazuri, cu o combinație de metotrexat cu ciclosporină A - în 9% din cazuri și cu administrarea doar de ciclosporină A - în 8% din cazuri (Gaziev și colab., 1995).

Complicațiile infecțioase după transplantul de măduvă osoasă sunt cauzate de virusuri, bacterii și ciuperci. Dezvoltarea lor este asociată cu neutropenie profundă indusă de medicamentele chimioterapice în perioada de condiționare, deteriorarea barierelor mucoase de către citostatice și reacția grefă-contra-gazdă. În funcție de momentul dezvoltării, se disting trei faze ale complicațiilor infecțioase. În prima fază (se dezvoltă în prima lună după transplant), predomină deteriorarea barierelor mucoase și neutropenia, adesea însoțite de infecții virale (herpes, virusul Epstein-Barr, citomegalovirus, varicelă zoster), precum și infecții cauzate de bacterii gram-pozitive și gram-negative, ciuperci Candida, aspergili. În perioada post-transplant timpurie (a doua și a treia lună după transplant), cea mai severă infecție este citomegalovirusul, care duce adesea la decesul pacienților în a doua fază a complicațiilor infecțioase. În talasemie, infecția cu citomegalovirus după transplantul de măduvă osoasă se dezvoltă la 1,7-4,4% dintre receptori. A treia fază se observă în perioada post-transplant târzie (la trei luni după operație) și este caracterizată prin imunodeficiență combinată severă. Infecțiile cauzate de Varicella zoster, streptococ, Pneumocystis carinii, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae și virusuri hepatotropice sunt frecvente în această perioadă. În talasemie, mortalitatea pacienților după transplantul de măduvă osoasă este asociată cu sepsis bacterian și fungic, pneumonie interstițială și cu citomegalovirus idiopatică, sindrom de detresă respiratorie acută, insuficiență cardiacă acută, tamponadă cardiacă, hemoragie cerebrală, boală hepatică veno-ocluzivă și boală grefă-contra-gazdă acută.

În prezent, s-au obținut anumite succese în dezvoltarea metodelor de izolare a populațiilor pure de celule stem hematopoietice din măduva osoasă. Tehnica de obținere a sângelui fetal din cordonul ombilical a fost îmbunătățită și au fost create metode de izolare a celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical. Există rapoarte în presa științifică conform cărora celulele stem hematopoietice sunt capabile să se multiplice atunci când sunt cultivate în medii cu citokine. Atunci când se utilizează bioreactoare special concepute pentru extinderea celulelor stem hematopoietice, biomasa celulelor stem hematopoietice izolate din măduva osoasă, sângele periferic sau din cordonul ombilical crește semnificativ. Posibilitatea extinderii celulelor stem hematopoietice este un pas important către dezvoltarea clinică a transplantului de celule.

Totuși, înainte de propagarea in vitro a celulelor stem hematopoietice, este necesară izolarea unei populații omogene de celule stem hematopoietice. Acest lucru se realizează de obicei folosind markeri care permit marcarea selectivă a celulelor stem hematopoietice cu anticorpi monoclonali legați covalent de un marker fluorescent sau magnetic și izolarea lor folosind un sortator de celule adecvat. În același timp, problema caracteristicilor fenotipice ale celulelor stem hematopoietice nu a fost rezolvată definitiv. A. Petrenko, V. Grishchenko (2003) consideră celulele cu antigene CD34, AC133 și Thyl pe suprafața lor și fără CD38, HLA-DR sau alți markeri de diferențiere (celule cu fenotipul CD34+Liir) drept candidate pentru celule stem hematopoietice. Markerii de linie genealogică (Lin) includ glicoforina A (GPA), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Celulele cu fenotipul CD34+CD45RalüW CD71low, precum și fenotipul CD34+Thyl+CD38low/c-kit/low, sunt considerate promițătoare pentru transplant.

Problema numărului de celule stem hematopoietice suficiente pentru un transplant eficient rămâne o problemă. În prezent, sursele de celule stem hematopoietice sunt măduva osoasă, sângele periferic și din cordonul ombilical și ficatul embrionar. Extinderea celulelor stem hematopoietice se realizează prin cultivarea acestora în prezența celulelor endoteliale și a factorilor de creștere hematopoietici. În diverse protocoale, mieloproteinele, SCF, eritropoietina, factorii de creștere asemănători insulinei, corticosteroizii și estrogenii sunt utilizați pentru a induce proliferarea HSC. Atunci când se utilizează combinații de citokine in vitro, este posibil să se obțină o creștere semnificativă a rezervei de HSC, cu un vârf al producției lor la sfârșitul celei de-a doua săptămâni de cultivare.

În mod tradițional, transplantul de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical este utilizat în principal pentru tratarea hemoblastozelor. Cu toate acestea, doza minimă de celule hematopoietice necesară pentru un transplant reușit de celule din sângele cordonului ombilical este de 3,7 x 107 ^celule nucleate la 1 kg de greutate corporală a receptorului. Utilizarea unui număr mai mic de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical crește semnificativ riscul de eșec al grefei și de recidivă a bolii. Prin urmare, transplantul de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical este utilizat în principal pentru tratarea hemoblastozelor la copii.

Din păcate, încă nu există standarde pentru obținerea sau protocoale standardizate pentru utilizarea clinică a celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical. Prin urmare, celulele stem din sângele cordonului ombilical în sine nu reprezintă o sursă recunoscută legal de celule hematopoietice pentru transplant. În plus, nu există norme etice sau juridice care să guverneze activitățile și organizarea băncilor de sânge din cordonul ombilicalb, care există în străinătate. Între timp, pentru un transplant sigur, toate probele de sânge din cordonul ombilical trebuie monitorizate cu atenție. Înainte de a recolta sânge de la o femeie însărcinată, trebuie obținut consimțământul acesteia. Fiecare femeie însărcinată trebuie examinată pentru purtătorul de HBsAg, prezența anticorpilor împotriva virusurilor hepatitei C, HIV și sifilisului. Fiecare probă de sânge din cordonul ombilical trebuie testată ca standard pentru numărul de celule nucleate, CD34+ și capacitatea de formare a coloniilor. În plus, se efectuează tipizarea HbA1c, determinarea grupei sanguine prin ABO și apartenența acesteia la factorul Rh. Procedurile de testare necesare sunt cultura bacteriologică pentru sterilitate, testarea serologică pentru infecțiile cu HIV-1 și HIV-2, HBsAg, hepatita virală C, infecția cu citomegalovirus, HTLY-1 și HTLY-II, sifilis și toxoplasmoză. În plus, se efectuează reacția în lanț a polimerazei pentru a detecta infecțiile cu citomegalovirus și HIV. Se pare recomandabil să se suplimenteze protocoalele de testare cu o analiză a probelor de sânge din cordonul ombilical (GSC) pentru a detecta boli genetice precum α-talasemia, anemia falciformă, deficitul de adenozin deaminază, agamaglobulinemia Bruton, bolile Hurler și Ponter.

Următoarea etapă a pregătirii pentru transplant este problema conservării celulelor stem hematopoietice. Cele mai periculoase proceduri pentru viabilitatea celulelor în timpul preparării lor sunt congelarea și decongelarea. La congelarea celulelor hematopoietice, o parte semnificativă a acestora poate fi distrusă din cauza formării cristalelor. Substanțe speciale - crioprotectori - sunt utilizate pentru a reduce procentul de moarte celulară. Cel mai adesea, DMSO este utilizat ca crioprotector într-o concentrație finală de 10%. Cu toate acestea, DMSO într-o astfel de concentrație se caracterizează printr-un efect citotoxic direct, care se manifestă chiar și în condiții de expunere minimă. O scădere a efectului citotoxic se realizează prin menținerea strictă a temperaturii zero a modului de expunere, precum și prin respectarea reglementărilor de procesare a materialului în timpul și după decongelare (viteza tuturor manipulărilor, utilizarea procedurilor multiple de spălare). Nu trebuie utilizate concentrații de DMSO mai mici de 5%, deoarece acest lucru provoacă moartea masivă a celulelor hematopoietice în perioada de congelare.

Prezența impurităților eritrocitare în amestecul de suspensie de celule stem hematopoietice creează riscul dezvoltării unei reacții de incompatibilitate pentru antigenele eritrocitare. În același timp, atunci când eritrocitele sunt îndepărtate, pierderea celulelor hematopoietice crește semnificativ. În acest sens, a fost propusă o metodă de izolare nefracționată a celulelor stem hematopoietice. În acest caz, se utilizează o soluție de DMSO 10% și răcire la viteză constantă (GS/min) până la -80°C pentru a proteja celulele nucleate de efectele dăunătoare ale temperaturilor scăzute, după care suspensia celulară este congelată în azot lichid. Se crede că această metodă de crioconservare are ca rezultat liza parțială a eritrocitelor, astfel încât probele de sânge nu necesită fracționare. Înainte de transplant, suspensia celulară este decongelată, spălată de hemoglobina liberă și DMSO într-o soluție de albumină umană sau în ser sanguin. Conservarea precursorilor hematopoietici folosind această metodă este într-adevăr mai mare decât după fracționarea sângelui din cordonul ombilical, dar riscul complicațiilor transfuzionale datorate transfuziei de eritrocite ABO-incompatibile rămâne.

Crearea unui sistem bancar pentru stocarea probelor de HSC testate HLA și tipizate ar putea rezolva problemele menționate mai sus. Cu toate acestea, acest lucru necesită dezvoltarea unor norme etice și juridice, care în prezent sunt abia în curs de discuție. Înainte de a crea o rețea bancară, este necesară adoptarea unui număr de reglementări și documente privind standardizarea procedurilor de colectare, fracționare, testare și tipizare, precum și crioconservarea HSC. O condiție obligatorie pentru funcționarea eficientă a băncilor de HSC este organizarea unei baze informatice pentru interacțiunea cu registrele Asociației Mondiale a Donatorilor de Măduvă (WMDA) și ale Programului Național al Donatorilor de Măduvă din Statele Unite (NMDP).

În plus, este necesară optimizarea și standardizarea metodelor de extindere in vitro a HSC-urilor, în principal a celulelor hematopoietice din sângele cordonului ombilical. Expansiunea HSC-urilor din sângele cordonului ombilical este necesară pentru a crește numărul de potențiali receptori compatibili cu sistemul HLA. Datorită volumelor mici de sânge din cordonul ombilical, numărul de HSC-uri conținute în acesta nu este de obicei capabil să asigure repopularea măduvei osoase la pacienții adulți. În același timp, pentru a efectua transplanturi fără legătură de rudenie, este necesar să se aibă acces la un număr suficient de probe HSC tipizate (de la 10.000 la 1.500.000 per receptor).

Transplantul de celule stem hematopoietice nu elimină complicațiile care însoțesc transplantul de măduvă osoasă. Analizele arată că, în cazul transplantului de celule stem din sângele cordonului ombilical, forme severe de boală acută grefă-contra-gazdă se dezvoltă la 23% dintre receptori, iar forme cronice la 25% dintre receptori. La pacienții oncohematologici, recidivele de leucemie acută în primul an după transplantul de celule stem din sângele cordonului ombilical se observă în 26% din cazuri.

În ultimii ani, metodele de transplant de celule stem hematopoietice periferice s-au dezvoltat intens. Conținutul de HSC în sângele periferic este atât de mic (1 HSC la 100.000 de celule sanguine) încât izolarea lor fără o pregătire specială nu are sens. Prin urmare, donatorului i se administrează mai întâi un tratament de stimulare medicamentoasă a eliberării celulelor hematopoietice din măduva osoasă în sânge. În acest scop, se utilizează medicamente departe de a fi inofensive, precum ciclofosfamida și factorul de stimulare a coloniilor de granulocite. Dar chiar și după procedura de mobilizare a HSC în sângele periferic, conținutul de celule CD34+ din acestea nu depășește 1,6%.

Pentru mobilizarea celulelor stem hematopoietice în clinică, cel mai adesea se utilizează S-SEC, care se caracterizează printr-o toleranță relativ bună, cu excepția apariției aproape naturale a durerilor osoase. Trebuie menționat că utilizarea separatoarelor de sânge moderne permite izolarea eficientă a celulelor stem hematopoietice. Cu toate acestea, în condiții normale de hematopoieză, trebuie efectuate cel puțin 6 proceduri pentru a obține un număr suficient de celule stem hematopoietice comparabile ca capacitate de repopulare cu suspensia de măduvă osoasă. Fiecare astfel de procedură necesită procesarea a 10-12 litri de sânge pe separator, ceea ce poate provoca trombocitopenie și leucopenie. Procedura de separare implică introducerea unui anticoagulant (citrat de sodiu) la donator, ceea ce nu exclude, însă, activarea prin contact a trombocitelor în timpul centrifugării extracorporale. Acești factori creează condiții pentru dezvoltarea complicațiilor infecțioase și hemoragice. Un alt dezavantaj al metodei este variabilitatea semnificativă a răspunsului de mobilizare, care necesită monitorizarea conținutului de HSC-uri în sângele periferic al donatorilor, necesară pentru a determina nivelul lor maxim.

Transplantul autogen de celule stem hematopoietice, spre deosebire de transplantul alogen, elimină complet dezvoltarea reacției de rejet. Cu toate acestea, un dezavantaj semnificativ al autotransplantării de celule stem hematopoietice, care limitează gama de indicații pentru implementarea sa, este probabilitatea ridicată de reinfuzare a celulelor clonate leucemice odată cu transplantul. În plus, absența efectului imunomediat „grefă contra tumoră” crește semnificativ frecvența recidivelor hematopatiei maligne. Prin urmare, singura metodă radicală de eliminare a hematopoiezei clonale neoplazice și de restabilire a hematopoiezei policlonale normale în sindroamele mielodisplazice rămâne polichimioterapia intensivă cu transplant de hematopoieză alogenă.

Însă chiar și în acest caz, tratamentul pentru majoritatea hemoblastozelor vizează doar creșterea timpului de supraviețuire a pacienților și îmbunătățirea calității vieții acestora. Conform mai multor studii ample, supraviețuirea pe termen lung fără recidivă după alotransplantarea de HSC este obținută la 40% dintre pacienții oncohematologici. Atunci când se utilizează celule stem de la o rudă compatibilă cu HLA, cele mai bune rezultate se observă la pacienții tineri cu un istoric scurt al bolii, un număr de celule blastice de până la 10% și o citogenetică favorabilă. Din păcate, mortalitatea asociată cu procedura de alotransplantare de HSC la pacienții cu boli mielodisplazice rămâne ridicată (în majoritatea rapoartelor - aproximativ 40%). Rezultatele activității de 10 ani a Programului Național de Donare a Măduvei Osoase din SUA (510 pacienți, vârsta mediană - 38 de ani) indică faptul că supraviețuirea fără recidivă timp de doi ani este de 29%, cu o probabilitate relativ scăzută de recidivă (14%). Cu toate acestea, mortalitatea asociată cu procedura de alotransplantare a HSC-urilor de la un donator neînrudit este extrem de ridicată și atinge 54% pe o perioadă de doi ani. Rezultate similare au fost obținute într-un studiu european (118 pacienți, vârsta mediană - 24 de ani, supraviețuirea fără recidivă la doi ani - 28%, recidivă - 35%, mortalitate - 58%).

În timpul curelor intensive de chimioterapie cu restabilirea ulterioară a hematopoiezei cu celule hematopoietice alogene, apar adesea complicații imunohematologice și transfuzionale. Acestea se datorează în mare măsură faptului că grupele sanguine umane sunt moștenite independent de moleculele MHC. Prin urmare, chiar dacă donatorul și primitorul sunt compatibili pentru principalii antigeni HLA, eritrocitele lor pot avea fenotipuri diferite. Se face distincție între incompatibilitatea „majoară”, atunci când primitorul are anticorpi preexistenți împotriva antigenelor eritrocitare ale donatorului, și incompatibilitatea „minoră”, atunci când donatorul are anticorpi împotriva antigenelor eritrocitare ale primitorului. Sunt posibile cazuri de combinare a incompatibilității „majoare” și „minore”.

Rezultatele unei analize comparative a eficacității clinice a alotransplantării de celule stem hematopoietice din măduvă osoasă și sânge din cordonul ombilical în hemoblastoze indică faptul că la copii, după alotransplantarea de celule stem hematopoietice din sângele cordonului ombilical, riscul de a dezvolta o reacție grefă-contra-gazdă este semnificativ redus, dar se observă o perioadă mai lungă de recuperare a numărului de neutrofile și trombocite, cu o incidență mai mare a mortalității la 100 de zile post-transplant.

Studiul cauzelor mortalității precoce a permis clarificarea contraindicațiilor transplantului alogen de celule stem stem (HSC), printre care cele mai importante sunt:

• prezența testelor pozitive pentru infecția cu citomegalovirus la primitor sau donator (fără tratament preventiv);
• boala acută de radiații;
• prezența sau chiar suspiciunea prezenței unei infecții micotice la un pacient (fără efectuarea profilaxiei sistemice precoce cu medicamente fungicide);
• hemoblastoze, în care pacienții au primit tratament pe termen lung cu citostatice (din cauza probabilității mari de stop cardiac brusc și insuficiență multiplă de organe);
• transplant de la donatori HLA non-identici (fără profilaxia reacției acute grefă-contra-gazdă cu ciclosporină A);
• hepatită virală cronică C (din cauza riscului ridicat de a dezvolta boală veno-ocluzivă a ficatului).

Astfel, transplantul de HSC poate provoca complicații grave, care duc adesea la deces. În perioada incipientă (până la 100 de zile după transplant), acestea includ complicații infecțioase, boala grefă-contra-gazdă acută, respingerea grefei (eșecul HSC-urilor donatoare), boală hepatică veno-ocluzivă, precum și leziuni tisulare cauzate de toxicitatea regimului de condiționare, care se caracterizează printr-o rată ridicată de remodelare (piele, endoteliu vascular, epiteliu intestinal). Complicațiile perioadei post-transplant târzii includ boala grefă-contra-gazdă cronică, recidivele bolii de bază, retardul de creștere la copii, disfuncția sistemului reproducător și a glandei tiroide și leziunile oculare.

Recent, în legătură cu publicațiile despre plasticitatea celulelor măduvei osoase, a apărut ideea utilizării HSC-urilor pentru tratarea atacurilor de cord și a altor boli. Deși unele experimente pe animale susțin această posibilitate, concluziile despre plasticitatea celulelor măduvei osoase trebuie confirmate. Această circumstanță ar trebui luată în considerare de către cercetătorii care cred că celulele măduvei osoase umane transplantate se transformă ușor în celule musculare scheletice, miocardice sau ale SNC. Ipoteza că HSC-urile sunt o sursă celulară naturală de regenerare a acestor organe necesită dovezi serioase.

În special, au fost publicate primele rezultate ale unui studiu randomizat deschis realizat de V. Belenkov (2003). Scopul acestuia a fost de a studia efectul C-SvK (adică mobilizarea HSC-urilor autologe în sânge) asupra stării clinice, hemodinamice și neurohumorale a pacienților cu insuficiență cardiacă cronică moderată până la severă, precum și de a evalua siguranța acesteia în contextul terapiei standard (inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei, beta-blocante, diuretice, glicozide cardiace). În prima publicare a rezultatelor studiului, autorii programului notează că singurul argument în favoarea O-SvK îl reprezintă rezultatele tratării unui pacient, care a prezentat o îmbunătățire incontestabilă a tuturor parametrilor clinici și hemodinamici în contextul terapiei cu acest medicament. Cu toate acestea, teoria mobilizării HSC-urilor în fluxul sanguin cu regenerare miocardică ulterioară în zona post-infarct nu a fost confirmată - chiar și la un pacient cu dinamică clinică pozitivă, ecocardiografia de stres cu dobutamină nu a evidențiat apariția unor zone de miocard viabil în zona cicatricială.

Trebuie menționat că, în prezent, există în mod evident suficiente date pentru a recomanda terapia celulară de substituție pentru implementare pe scară largă în practica clinică de zi cu zi. Sunt necesare studii clinice bine concepute și de înaltă calitate pentru a determina eficacitatea diferitelor opțiuni de terapie celulară regenerativă, a dezvolta indicații și contraindicații pentru aceasta, precum și ghiduri pentru utilizarea combinată a terapiei regenerativ-plastice și a tratamentului chirurgical sau conservator tradițional. Încă nu există un răspuns la întrebarea care populație particulară de celule ale măduvei osoase (hematopoietice sau stromale stem) poate da naștere neuronilor și cardiomiocitelor și, de asemenea, nu este clar ce condiții contribuie la acest lucru in vivo.

În multe țări se desfășoară activități în aceste domenii. În rezumatul simpozionului privind insuficiența hepatică acută al Institutului Național de Sănătate din SUA, printre metodele promițătoare de tratament, alături de transplantul hepatic, se menționează transplantul de hepatocite xeno- sau alogene și conectarea extracorporală a bioreactoarelor cu celulele hepatice. Există dovezi directe că doar hepatocitele străine, funcțional active, sunt capabile să ofere un suport eficient ficatului receptorului. Pentru utilizarea clinică a hepatocitelor izolate, este necesară crearea unei bănci de celule, care va reduce semnificativ timpul dintre izolarea celulelor și utilizarea lor. Cea mai acceptabilă metodă de creare a unei bănci de hepatocite izolate este crioconservarea celulelor hepatice în azot lichid. Atunci când se utilizează astfel de celule în clinică la pacienții cu insuficiență hepatică acută și cronică, s-a demonstrat un efect terapeutic destul de ridicat.

În ciuda rezultatelor optimiste și încurajatoare ale transplantului de celule hepatice în experimente și practica clinică, există încă multe probleme care sunt departe de a fi rezolvate. Acestea includ un număr limitat de organe potrivite pentru obținerea hepatocitelor izolate, metode insuficient eficiente pentru izolarea acestora, absența metodelor standardizate pentru conservarea celulelor hepatice, idei neclare despre mecanismele de reglare a creșterii și proliferării celulelor transplantate, absența metodelor adecvate pentru evaluarea grefării sau respingerii hepatocitelor alogene. Aceasta include și prezența imunității de transplant atunci când se utilizează celule alogene și xenogene, deși mai puțin decât în transplantul hepatic ortotopic, dar necesitând utilizarea imunosupresoarelor, încapsularea hepatocitelor izolate sau tratamentul lor special cu enzime. Transplantul de hepatocite duce adesea la un conflict imun între receptor și donator sub forma unei reacții de respingere, care necesită utilizarea citostaticelor. O soluție la această problemă poate fi utilizarea purtătorilor microporoși polimerici pentru izolarea celulelor hepatice, ceea ce va îmbunătăți supraviețuirea acestora, deoarece membrana capsulei protejează eficient hepatocitele în ciuda imunizării gazdei.

Cu toate acestea, în insuficiența hepatică acută, un astfel de transplant de hepatocite este ineficient din cauza timpului relativ lung necesar celulelor hepatice pentru a se grefa într-un mediu nou și a atinge stadiul de funcționare optimă. O potențială limitare este secreția de bilă în timpul transplantului ectopic de hepatocite izolate, iar atunci când se utilizează bioreactoare, o barieră fiziologică semnificativă este nepotrivirea dintre speciile umane și proteinele produse de hepatocitele xenogene.

În literatura de specialitate există rapoarte care arată că transplantul local de celule stem stromale din măduva osoasă facilitează corectarea eficientă a defectelor osoase, iar restaurarea țesutului osos în acest caz are loc mai intens decât în cazul regenerării reparative spontane. Mai multe studii preclinice pe modele experimentale demonstrează în mod convingător posibilitatea utilizării transplanturilor de celule stem stromale din măduva osoasă în ortopedie, deși sunt necesare lucrări suplimentare pentru optimizarea acestor metode, chiar și în cele mai simple cazuri. În special, nu au fost încă găsite condiții optime pentru extinderea celulelor stromale osteogene ex vivo, iar structura și compoziția purtătorului (matricei) lor ideale rămân nedezvoltate. Numărul minim de celule necesar pentru regenerarea osoasă volumetrică nu a fost determinat.

S-a dovedit că celulele stem mezenchimale prezintă plasticitate transgermală, adică capacitatea de a se diferenția în tipuri de celule fenotipic neînrudite cu celulele liniei originale. În condiții optime de cultivare, liniile de celule stem stromale policlonale din măduva osoasă pot rezista la peste 50 de diviziuni in vitro, ceea ce face posibilă obținerea de miliarde de celule stromale din 1 ml de aspirat de măduvă osoasă. Cu toate acestea, populația de celule stem mezenchimale este eterogenă, ceea ce se manifestă atât prin variabilitatea dimensiunilor coloniilor, ratele diferite de formare a acestora, cât și prin diversitatea morfologică a tipurilor de celule, de la celule fusiforme asemănătoare fibroblastelor, până la celule plate mari. Heterogenitatea fenotipică se observă după doar 3 săptămâni de cultivare a celulelor stem stromale: unele colonii formează noduli de țesut osos, altele formează grupuri de adipocite, iar altele, mai rare, formează insule de țesut cartilaginos.

Transplantul de țesut nervos embrionar a fost inițial utilizat pentru tratarea bolilor degenerative ale sistemului nervos central. În ultimii ani, în locul țesutului cerebral embrionar au fost transplantate elemente celulare ale neurosferelor obținute din celule stem neuronale (Poltavtseva, 2001). Neurosferele conțin precursori dedicați neuronilor și neurogliei, ceea ce oferă speranță pentru restaurarea funcțiilor cerebrale pierdute după transplantul lor. După transplantul de celule neurosferice dispersate în regiunea striată a creierului de șobolan, s-a observat proliferarea și diferențierea acestora în neuroni dopaminergici, ceea ce a eliminat asimetria motorie la șobolanii cu hemiparkinsonism experimental. Cu toate acestea, în unele cazuri, din celulele neurosferice s-au dezvoltat tumori, ceea ce a dus la moartea animalelor (Bjorklund, 2002).

În clinică, studii atente efectuate pe două grupuri de pacienți, în care nici pacienții, nici medicii care îi observau nu știau (studiu dublu-orb), că unui grup de pacienți i s-a transplantat țesut embrionar cu neuroni producători de dopamină, iar celui de-al doilea grup de pacienți i s-a efectuat o operație simulată, au dat rezultate neașteptate. Pacienții cărora li s-a transplantat țesut nervos embrionar nu s-au simțit mai bine decât pacienții din grupul de control. În plus, 5 din 33 de pacienți au dezvoltat diskinezie persistentă la 2 ani după transplantul de țesut nervos embrionar, care nu era prezentă la pacienții din grupul de control (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Una dintre problemele nerezolvate ale cercetării clinice a celulelor stem neuronale ale creierului rămâne analiza perspectivelor și limitelor reale ale transplantului derivatelor acestora pentru corectarea tulburărilor SNC. Este posibil ca neuronogeneza din hipocampus indusă de activitatea convulsivă prelungită, care duce la reorganizarea sa structurală și funcțională, să fie un factor în dezvoltarea progresivă a epilepsiei. Această concluzie merită o atenție specială, deoarece indică posibile consecințe negative ale generării de noi neuroni în creierul matur și formarea de conexiuni sinaptice aberante de către aceștia.

Nu trebuie uitat faptul că cultivarea în medii cu citokine (mitogene) apropie caracteristicile celulelor stem de cele ale celulelor tumorale, deoarece la acestea apar modificări similare în reglarea ciclurilor celulare, determinând capacitatea de diviziune nelimitată. Transplantarea derivatelor timpurii ale celulelor stem embrionare la o persoană este imprudentă, deoarece în acest caz amenințarea dezvoltării de neoplasme maligne este foarte mare. Este mult mai sigur să se utilizeze urmașii lor mai dedicați, adică celulele precursoare ale liniilor diferențiate. Cu toate acestea, în prezent, nu a fost încă dezvoltată o tehnică fiabilă pentru obținerea de linii stabile de celule umane care se diferențiază în direcția dorită.

Utilizarea tehnologiilor de biologie moleculară pentru corectarea patologiei ereditare și a bolilor umane prin modificarea celulelor stem prezintă un mare interes pentru medicina practică. Caracteristicile genomului celulelor stem fac posibilă dezvoltarea de scheme unice de transplant pentru corectarea bolilor genetice. Cu toate acestea, există o serie de limitări în acest domeniu care trebuie depășite înainte de aplicarea practică a ingineriei genetice cu celule stem. În primul rând, este necesar să se optimizeze procesul de modificare ex vivo a genomului celulelor stem. Se știe că proliferarea pe termen lung (3-4 săptămâni) a celulelor stem reduce transfecția acestora, astfel încât sunt necesare mai multe cicluri de transfecție pentru a atinge un nivel ridicat de modificare genetică a acestora. Cu toate acestea, principala problemă este asociată cu durata expresiei genelor terapeutice. Până în prezent, în niciun studiu perioada de expresie eficientă după transplantul de celule modificate nu a depășit patru luni. În 100% din cazuri, în timp, expresia genelor transfectate scade din cauza inactivării promotorilor și/sau a morții celulelor cu un genom modificat.

O problemă importantă este costul utilizării tehnologiilor celulare în medicină. De exemplu, nevoia anuală estimată pentru finanțarea doar a cheltuielilor medicale ale unei unități de transplant de măduvă osoasă, concepută să efectueze 50 de transplanturi pe an, este de aproximativ 900.000 USD.

Dezvoltarea tehnologiilor celulare în medicina clinică este un proces complex și în mai multe etape, care implică o cooperare constructivă între centrele științifice și clinice multidisciplinare și comunitatea internațională. În același timp, problemele de organizare științifică a cercetării în domeniul terapiei celulare necesită o atenție deosebită. Cele mai importante dintre acestea sunt dezvoltarea protocoalelor de cercetare clinică, controlul fiabilității datelor clinice, formarea unui registru național de studii, integrarea în programe internaționale a studiilor clinice multicentrice și implementarea rezultatelor în practica clinică.

În concluzie a introducerii la problemele transplantologiei celulare, aș dori să-mi exprim speranța că unificarea eforturilor specialiștilor ucraineni de renume din diverse domenii ale științei va asigura progrese semnificative în cercetarea experimentală și clinică și va face posibilă în următorii ani găsirea unor modalități eficiente de a oferi asistență persoanelor grav bolnave care au nevoie de transplant de organe, țesuturi și celule.

[ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ], [ 17 ], [ 18 ]