Celulele stem hematopoietice

Celulele stem hematopoietice (CSH) ca celule progenitoare mezenchimale sunt caracterizate prin multipotenței și dau naștere la linii celulare, elemente finite care formează celule sanguine și unele celule tisulare specializate ale sistemului imunitar.

Ipoteza existenței unui strămoș comun al tuturor celulelor sanguine, precum si termenul „celula stem“, deținută de A. Maximov (1909) Formarea potențială a masei de celule de la GSK imens -. Celulele stem maduvei osoase produc celulele 10-a zi care alcatuiesc sanguini ale perifericului în sine. Existența celulelor stem hematopoietice a fost stabilit în 1961 în experimente privind recuperarea hematopoieza la șoarecii care au primit o doza letala de expunere la radiații, care distruge celulele stem maduvei osoase. Pos și anume transplantul de celule de măduvă osoasă singenice, astfel lethally iradiate animale focare discrete hematopoiezei au fost detectate în splina destinatari a căror sursă - celule precursoare clonogenic singulare.

Apoi, a fost demonstrată capacitatea celulelor stem hematopoietice de a se autoperfora, ceea ce asigură funcția hematopoiezei în timpul ontogenezei. În procesul dezvoltării embrionare, HSC-urile sunt caracterizate de o activitate de migrație ridicată, care este necesară pentru migrarea lor la situsurile organelor hematopoietice. Această proprietate a HSCs este reținută și în ontogeneză - datorită migrării lor constante, are loc o reînnoire permanentă a grupului de celule imunocompetente. Capacitatea migrației GSK, penetrarea prin barierele sânge tisulare, implantarea în creștere tisulară și clonogenic furnizat baza pentru celulele de transplant de măduvă osoasă într-un număr de boli asociate cu tulburări ale sistemului hematopoietic.

La fel ca toate resursele de celule stem, celulele stem hematopoietice sunt prezente în nișă (măduva osoasă) în cantități foarte mici, ceea ce conduce la anumite dificultăți în alocarea lor. CSH umane immunophenotypic sunt caracterizate ca celule CD34 + NK capabile să migreze în fluxul sanguin și colonizează organele sistemului imunitar sau pentru a repopula stroma măduvei osoase. Este necesar să se înțeleagă în mod clar că GSK nu este cel mai imature celule de măduvă osoasă, și sunt derivate din precursori, care includ dormantnye fibroblastice SB34-negativ celule. Sa constatat ca celulele cu fenotipul CD34 sunt capabili de a intra în fluxul sanguin, în cazul în care schimbă fenotipul lor în CD34 +, dar migrația de revenire în măduva osoasă sub influența micromediul deveni din nou elemente de celule stem CD34-negativ. În repaus, celulele CD34 nu răspund la semnale stromale regulate paracrine (factori de creștere, citokine). Cu toate acestea, în situațiile care necesită intensitate de amplificare a celulelor stem hematopoietice cu CD34 fenotip răspunde la semnalele de diferențiere a forma atât hematopoietice și celulelor progenitoare mezenchimale. Hematopoieza se realizează prin contactul direct cu GSK elemente celulare ale stromei măduvei osoase au prezentat o retea complexa de macrofage, celule endoteliale, osteoblastele reticular, fibroblaste stromale și matrice extracelulară. Bone Cadrul stromă de măduvă osoasă - nu numai o matrice sau „schelet“ pentru tesutul hematopoietic, transporta reglarea fină a hematopoiezei datorită semnalelor de reglementare paracrine de factori de creștere, citokine și chemokine, și oferă, de asemenea, interacțiunile adezive necesare pentru formarea celulelor sanguine.

Astfel, baza sistemului hematopoietic actualizat continuu se află pluripotente (din punctul de vedere al hematopoiezei) celule stem hematopoietice capabile pe termen lung de auto-reînnoire. În timpul procesului de comitere, HSCs suferă o diferențiere primară și formează clone de celule care diferă prin caracteristicile lor cytomorfologice și imunofenotipice. Formarea consecutivă a celulelor progenitoare primitive și comise este completată de formarea celulelor strămoșilor identificabili morfologic de diferite linii hematopoietice. Rezultatul procesului complex în mai multe etape etapele ulterioare este maturarea celulelor hematopoietice și randamentul matur elementelor formate din sângele periferic - eritrocite, leucocite, limfocite și trombocite.

[1], [2], [3], [4], [5]

Surse de celule stem hematopoietice

Celulele stem hematopoietice sunt considerate sursa stem mai studiat, care este în mare parte datorită utilizării lor în clinica de transplant de măduvă osoasă. La prima vedere, se cunosc multe despre aceste celule. Într-o anumită măsură, acest lucru este adevărat, deoarece intermediare și mature descendenții GSK - elementele celulare mai accesibile, fiecare dintre acestea (eritrocite, leucocite, limfocite, monocite / macrofage și trombocite) sunt bine studiate la toate nivelurile - de la lumină la electroni microscopie, din biochimice și imunofenotipice înainte de identificarea prin analiza PCR. Cu toate acestea, monitorizarea efectuată de morfologic, ultrastructurale, biochimice, imunofenotipice si parametrii biofizici ai GSK genomice nu a dat raspunsuri la multe aspecte problematice, este necesară pentru dezvoltarea transplantului de celule soluția care. Nu este încă stabilit mecanisme de stabilizare GSK in stare latente, ele sunt activate, intră în etapa a diviziunii simetrice sau asimetrice, și cel mai important - angajamentul de a educației ca funcțional diferite de celule sanguine, eritrocite, leucocite, limfocite și trombocite.

Prezența în celulele de măduvă osoasă cu fenotip CD34, care sunt strămoșii celulelor stem atât mezenchimale și hematopoietice a ridicat problema existenței mai vechi aproape de celulele CD34 negative în diferențierea celulei progenitoare și linia stromal hematopoietic. Metodă de cultivare prelungită a fost obținută prin așa-numita cultură pe termen lung „celule de deschidere“ (inițiatoare de cultură pe termen lung de celule - LTC-IC). Durata de viață a acestor celule progenitoare în formatoare de colonii din activitatea stromale de măduvă osoasă, pe baza unei combinații de factori de creștere este mai mare de 5 săptămâni, în timp ce viabilitatea unităților angajate formatoare de colonii (CFU) în cultura de doar 3 săptămâni. În prezent se crede că LTC-IC - analog funcțional GCW ca repopulyatsionnom la un potențial ridicat de aproximativ 20% LTC-IC sunt caracterizate printr-un fenotip CD34 + CD38 'și prezintă o mare capacitate de auto-reînnoire. Astfel de celule găsite în măduva osoasă umană cu frecvența 1:50 000. Cu toate acestea, trebuie recunoscut celule-limfoidoinitsiiruyuschie mieloid cele mai apropiate de HSC care sunt obținute în condiții de termen lung (15 săptămâni) de cultură. Astfel de celule sunt desemnate ca LTC, printre celulele măduvei osoase umane sunt găsite în 10 de ori mai puțin decât LTC-IC, și este format ca o linii de celule mieloide și stem hemopoetic limfoidă.

Desi celulele stem hematopoietice marcarea cu anticorpi monoclonali, urmată de identificarea imunofenotipice este principala metodă pentru identificarea și sortarea selectivă a celulelor stem hematopoietice cu potential utilizarea clinica a dedicat GSK astfel limitată. Blocarea receptorilor de anticorpi CD34 sau alte antigene de markeri în timpul sortării imunopozitive inevitabil modifică proprietățile celulelor izolate cu ea. Mai preferabil este secreția imuno-negativă a HSC pe coloanele magnetice. Cu toate acestea, în acest caz, de regulă, anticorpii monoclonali fixați pe un suport metalic sunt utilizați pentru sortare. În plus, important, ambele metode de izolare a HSC se bazează pe caracteristici fenotipice și nu pe caracteristici funcționale. Prin urmare, mulți cercetători preferă să utilizeze analiza parametrilor clonogenice GSK, ceea ce permite mărimea și compoziția coloniilor pentru a determina gradul de maturitate și direcția diferențierii celulelor precursoare. Se știe că în procesul de comitere a numărului de celule și a numărului de tipuri din colonie scade. De celule stem hematopoietice și celula fiica timpurie, numită „unitate monocit-megakariotsitokolonieobrazuyuschaya-granulocite eritrocitare“ (SFU-GEMM), creează mari colonii o cultură multiliniare conținând, respectiv, granulocite, eritrocite, monocite și megacariocite. Situat sub unitatea de linie granulocite descendență angajamentul monotsitokolonieobrazuyuschaya (SFU-GM) genereaza colonii de granulocite și macrofage și unități formatoare de colonii granulocite (SFU-G) - doar mici colonii de granulocite mature. Predecesor eritrocitare timpuriu - unitate burstoobrazuyuschaya de celule roșii din sânge (SFU-E) - este o sursă de colonie de celule roșii sanguine unitate formatoare de mari și mai mature (SFU-E) - colonii mici de celule roșii sanguine. În populația generală, cu creșterea celulelor în medii semisolide pot identifica celulele care formează șase tipuri de colonii mieloide: SFU-GEMM, GM-SFU, SFU-G, M-SFU, VFU-E și E-SFU).

Totuși, pe lângă derivații hematopoietici, orice material sursă pentru separarea HSC conține un număr semnificativ de celule concomitente. În acest sens, este necesară o purificare preliminară a transplantului, în primul rând, a celulelor active ale sistemului imunitar al donatorului. De obicei, pentru aceasta se folosește imunizarea pe baza expresiei limfocitelor a antigenilor specifici, ceea ce face posibilă izolarea și îndepărtarea acestora folosind anticorpi monoclonali. In plus, un transplant de măduvă osoasă tehnica immunorozetochnaya limfocitelor-T sărăcită, care se bazează pe formarea complexelor de limfocite CD4 + și anticorpi monoclonali specifici se îndepărtează eficient folosind afereză. Această tehnică asigură un material celular purificat cu 40-60% celule stem hematopoietice.

Creșterea numărului de celule precursoare datorită îndepărtării celulelor sanguine mature dintr-un produs leukapheresis se realizează prin centrifugare contracurent urmată de filtrare (în prezența chelator - citrat trisodic), printr-o coloană care conține fibre de nylon acoperite cu imunoglobulină umană. Aplicarea consecventă a acestor două tehnici asigură o curățare completă a transplantului de la trombocite, 89% din eritrocite și 91% din celulele albe din sânge. Datorită unei reduceri semnificative a pierderilor de HSC, nivelul celulelor CD34 + din masa totală a celulelor poate fi crescut la 50%.

Pentru caracteristicile funcționale ale celulelor stem hematopoietice izolate, se folosește capacitatea lor de a crea colonii de elemente de sânge mature în cultură. Analiza coloniilor formate face posibilă identificarea și cuantificarea tipurilor de celule progenitoare, gradul de comitere a acestora și stabilirea direcției de diferențiere. Activitatea clonogenică se determină în mediu semisolid, metilceluloză, agar, geluri de plasmă sau de fibrină, activitatea migrarea celulelor de reducere, prevenind fixarea lor pe suprafața din sticlă sau plastic. În condiții optime de cultură, clonele dintr-o singură celulă se dezvoltă în decurs de 7-18 zile. Dacă există mai puțin de 50 de celule în clonă, este identificată ca un singur grup, în cazul în care numărul de celule depășește 50 - ca o colonie. Se ia în considerare numărul de celule capabile să formeze o colonie (unități care formează colonii - CFU sau celule care formează colonii - COC). Trebuie remarcat faptul că parametrii și CFU nu corespund COC numărul de HSC în suspensia de celule, deși se corelează cu faptul că subliniază din nou necesitatea de a identifica activitatea funcțională (formatoare de colonii) de CSH in vitro.

Printre maduva osoasa celule stem hematopoietice au cel mai mare potențial proliferativ, formând astfel cea mai mare în cultura de dimensiunea coloniei. Prin numărul de astfel de colonii, se propune determinarea indirectă a numărului de celule stem. După formarea de colonii in vitro care depășește 0,5 mm în diametru și cu numărul de celule 1000, autorii au testat stabilitatea acestor celule la subletale doze de 5-fluorouracil și au examinat capacitatea lor de a repopula maduva osoasa lethally animalele iradiate. Pentru acești parametri izolați celule aproape imposibil de distins de GSK si a primit un simbol prescurtat al HPP-CFC - celule formatoare de colonii cu potențial proliferativ ridicat.

Se continuă căutarea posibilității unei selecții mai calitative a celulelor stem hematopoietice. Cu toate acestea, celulele stem hematopoietice sunt morfológicamente similare cu limfocite și sunt relativ uniforme de colectare de celule cu nuclee aproape rotunde, cromatinei și pulberi slabobazofilnoy cantitate mică de citoplasmă. Numărul exact este de asemenea dificil de determinat. Se presupune că GSK în măduva osoasă a unei persoane are loc cu o frecvență de 1 la 106 celule care conțin nuclee.

Identificarea celulelor stem hematopoietice

Pentru a îmbunătăți identificarea celulelor stem hematopoietice se realizează secvențial sau simultan (pe un Tere sorbitan cu canale multiple) cercetare spectru membrannosvyazannyh de antigeni, în care GSK fenotip CD34 + CD38 trebuie combinate cu lipsa unor markeri de diferențiere liniare, în particular antigene ale celulelor imunocompetente, cum ar fi CD4, și imunoglobulinele de suprafață glicoforin.

Practic, toate schemele de fenotipare a celulelor stem hematopoietice includ determinarea antigenului CD34. Această glicoproteină cu o masă moleculară de aproximativ 110 kDa, care transportă mai multe situsuri de glicozilare exprimat pe membrana celulelor plasmatice după activarea genei localizate pe cromozomul 1. Funcția moleculei CD34 este asociată cu interacțiunea mediată de L-selecină a celulelor precursoare hematopoietice timpurii cu baza stromală a măduvei osoase. Cu toate acestea, trebuie amintit că prezența antigenului CD34 de pe suprafata celulelor permite face doar o evaluare preliminară a conținutului GSK în suspensia de celule, așa cum este exprimată, și alte celule precursoare hematopoietice și celule de stromă de măduvă osoasă și celule endoteliale.

În timpul diferențierii celulelor progenitoare hematopoietice, expresia CD34 este redusă permanent. Celulele progenitoare comise de celulele eritrocitare, granulocite și monocite fie exprimă slab antigenul CD34, fie absent pe suprafața lor (fenotipul CD34). Pe membrana de suprafață a celulelor diferențiate ale măduvei osoase și celulelor sanguine mature, antigenul CD34 nu este detectat.

Trebuie remarcat faptul că, în dinamica diferențierii celulelor precursoare hematopoietice nu numai că reduce nivelul de expresie al CD34, dar paralel expresie crescută progresiv a antigenului CD38 - glicoproteină de membrană integrală cu greutate moleculară a activității ciclazei ADP-ribozil 46 kDa având NAD-glikogidrolaznoy și, sugerând implicarea în transportul și sinteza ADP-ribozei. Astfel, este posibil să se dubleze de verificare a gradului de implicare a celulelor progenitoare hematopoietice. Populația de celule cu fenotip CD34 + CD38 +, 90-99% celule de măduvă osoasă CD34-pozitive cuprinde celulele sușe cu limitate proliferativa potențial și diferențiere, în timp ce cu fenotipul celulelor CD34 + CD38 poate pretinde rolul GSK.

Într-adevăr, populația de celule din măduva osoasă descrisă de formula CD34 + CD38- conține un număr relativ mare de celule stem primitive care se pot diferenția în direcțiile mieloide și limfoide. În contextul cultivării pe termen lung cu fenotipul celulelor CD34 + CD38 'gestiona pentru a obține toate celulele sanguine mature: neutrofile, eozinofile, bazofile, monocitele, megacariocitelor, eritrocite și limfocite.

Relativ recent a constatat că celulele CD34 pozitive exprimă mai mult de doi marcator - AC133 și CD90 (Thy-1), care sunt de asemenea folosite pentru a identifica celulele stem hematopoietice. Antigenului Thy-1 este co-exprimat cu receptorul CD117 (c-kit) pe celulele CD34 + din măduva osoasă, din cordonul ombilical și în sângele periferic. Această suprafață fosfatidilinozitolsvyazyvayuschy glicoproteină cu o greutate moleculară de 25-35 kDa, care este implicată în procesele de adeziune celulară. Unii autori consideră că antigenul Thy-1 este markerul celor mai imature celule CD34-pozitive. Replicarea celulele cu fenotipul CD34 + Thy-1 + da naștere unor linii de cultură pe termen lung, pentru a forma celule fiice. Se sugerează că antigenul Thy-1 blochează semnalele de reglementare care determină oprirea diviziunii celulare. În ciuda faptului că celulele CD34 + Tu1 + sunt capabile de auto-reînnoire și crearea unor linii de cultură pe termen lung, fenotipul lor nu se poate referi numai la HSC, ca Thy-1 + conținut în greutatea totală a elementelor de celule CD34-pozitive este de aproximativ 50%, depasind cu mult numărul de celule hematopoietice.

Mai promițătoare pentru identificarea celulelor stem hematopoietice este AC133, un marker antigen al celulelor progenitoare hematopoietice, a căror expresie a fost detectată mai întâi pe celule hepatice embrionare. AC133 este o glicoproteină transmembranară care apare pe suprafața membranei celulare în primele etape ale maturării GSK - este posibil ca și mai devreme decât antigenul CD34. În studiile lui A. Petrenko și V. Grishchenko (2003), sa constatat că AC133 exprimă până la 30% din celulele CD34-pozitive ale ficatului embrionar.

Astfel, profilul ideal fenotipice a celulelor stem hematopoietice prin concepte de astăzi, suma schiță celulei, în circuitele care trebuie să fie prezente CD34 antigenele configurație, AC133 și Thy-1, dar nu există nici un loc pentru proiecții CD38 moleculare, HLA-DR și markeri de diferențiere lineară GPA , CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20.

GSK variație fenotipică portret poate fi o combinație de CD34 + CD45RalowCD71low, deoarece proprietățile celulelor descrise de această formulă nu diferă de parametrii funcționali ai celulelor cu fenotip CD34 + CD38. In plus, HSC umane pot fi identificate prin semne fenotipice CD34 + Thy-l + CD38Iow / „c-kit / low - doar 30 dintre aceste celule restabili complet hematopoieza la șoarecii lethally iradiate.

Din analiza caracteristicilor generale fenotipice ale celulelor măduvei osoase de fapt, a început 40 de ani de cercetare intensivă GSK simultan capabil atât de auto-reinnoire si de diferentiere a altor elemente celulare, permițând să justifice utilizarea transplantului de măduvă osoasă pentru a trata diverse patologii ale sistemului hematopoietic. Recent descoperite noi tipuri de celule stem nu au fost încă utilizate pe scară largă în practica clinică. Cu toate acestea, celulele din cordonul ombilical (cordonul ombilical) din sânge și ficat fetal se pot extinde în mod semnificativ transplantul de celule nu numai in hematologie, ci și în alte domenii ale medicinei, ca diferite de măduvă osoasă CSH ca o caracteristici de performanță și calitate cantitative stem.

Volumul de masă de celule hematopoietice de tulpină necesar pentru transplant se obține de obicei din măduvă osoasă, din sânge periferic și din cordonul ombilical, precum și din ficatul embrionar. În plus, celulele progenitoare de hematopoieză pot fi obținute in vitro prin propagarea CES, urmată de diferențierea direcțională a acestora în elementele celulare hematopoietice. A. Petrenko, V. Grishenko (2003) evidențiază în mod corect diferențe semnificative de proprietăți imunologice și capacitatea de a restabili hematopoiezei GSK origine diferită, datorită raportului inegal conținute în sursele lor de pluripotente timpurie și progenitoare comise mai târziu. În plus, celulele stem hematopoietice derivate din surse diferite de tulpini au asociații complet diferite de celule nehemopoietice cantitativ și calitativ.

O sursă tradițională de celule stem hematopoietice este măduva osoasă. O suspensie de celule din măduva osoasă este obținută din osul abdominal sau sternul prin leșiere sub anestezie locală. Suspensia astfel obținută este eterogenă și conține un amestec de HSC, elemente de celule stromale, celule progenitoare comise ale liniilor mieloide și limfoide, precum și elemente sanguine mature. Numărul celulelor cu fenotipurile CD34 + și CD34 + CD38 între celulele mononucleare ale măduvei osoase este de 0,5 la 3,6 și de la 0 la 0,5%, respectiv. Sângele periferic după mobilizarea indusă de G-CSF a HSC conține 0,4-1,6% CD34 + și 0-0,4% CD34 + CD38.

Un procent mai mare de celule cu CD34 + immunophenotype CD38 și sângele din cordonul CD34 + - și 0-0,6 OD-2,6%, iar numărul lor maxim este detectat printre celulele hepatice fetale hematopoietice - și 2,3 0,2-12,5 -35,8%, respectiv.

Cu toate acestea, calitatea materialului grefat depinde nu numai de cantitatea conținută în acesta din CD34 + celule, dar, de asemenea, cu privire la activitatea lor funcțională, care poate fi estimată prin nivelul de formare a coloniei in vivo (repopularea măduvei la animale lethally iradiate) și in vitro - de creștere a coloniilor pe medii semisolide . Sa constatat că colonia formarea și activitatea de proliferare a celulelor progenitoare hematopoietice cu fenotipul CD34 + CD38 HLA-DR, izolate din ficat fetal, măduvă osoasă fetale și sângele din cordonul ombilical, și depășește cu mult capacitatea de proliferare a hematopoietice celule formatoare de colonii de măduva osoasă și sângele periferic al unui adult. Analiza cantitativă și calitativă a GSK origini a relevat diferențe semnificative ale conținutului lor relative în suspensia de celule și funcționalitate. Numărul maxim de celule CD34 + (24,6%) observate în materialele altoi derivate din măduva osoasă fetale. Măduva osoasă a unui adult adult conține 2,1% elemente de celule CD34-pozitive. Dintre celulele mononucleare din sângele periferic uman adult doar 0,5% au un fenotip CD34 +, în timp ce sângele din cordonul ombilical cantitatea lor ajunge la 2%. Astfel formatoare de colonii capacitatea de CD34 + celule ale maduvei osoase fetale de 2,7 ori mai mare decât capacitatea de creștere clonale a măduvei osoase hematopoietice de celule umane adulte și celule sanguine din cordonul ombilical formează colonii considerabil mai mari decât elementele hematopoietice izolate din sângele periferic al adulților: 65,5 până la 40 și , 8 colonii / 105 celule, respectiv.

Diferențele în activitatea proliferativă și capacitatea formatoare de colonii de celule stem hematopoietice sunt asociate nu numai cu diferite grade de maturitate, dar, de asemenea, cu micromediul lor natural. Este cunoscut faptul că intensitatea proliferării și diferențierii celulelor stem viteza max determinată de influența de reglementare integrală a sistemului multicomponent de factori de creștere și citokine care sunt produse de ambele celule stem și elementele celulare ale micromediu-matrice stromal. Folosind populațiile de celule purificate și medii fără ser în scopul culturii celulare oferind factorilor de creștere caracterizati care au efecte stimulatoare și inhibitoare asupra celulelor stem de diferite niveluri, celule progenitoare și celule de angajate într-o anumită direcție liniară. Rezultatele acestor studii demonstreaza ca HSCs derivate din surse cu niveluri diferite de dezvoltare ontogenetică, difera atât fenotipic cât și funcțional. Pentru GSK, stau la etapele anterioare ale ontogenezei, caracterizate printr-un potențial ridicat de autoreproducere și activitatea proliferativă înaltă. Aceste celule sunt mai lungimea telomerilor și sunt supuse angajament descendență cu formarea liniilor celulare hematopoietice. Reacția sistemului imun la originea embrionară HSC este întârziată, deoarece astfel de celule exprimă ușor moleculele HLA. Există o gradație clară a conținutului relativ de stelată și capacitatea lor de a auto-reînnoi și numărul de linii care formează tipuri de angajament: CD34 + celule de ficat fetal> CD34 + celule de sânge din cordonul ombilical> CD34 + celule ale măduvei osoase. Este important ca aceste diferențe nu sunt unice pentru intra- și neo-postanatalnomu perioada timpurie a dezvoltării umane, dar și în întreaga ontogeniei - proliferative și activitatea formatoare de colonii de CSH derivate din măduva osoasă sau din sângele periferic al unui adult, invers proporțională cu vârsta donatorului.