Terapia genică non-virală oferă speranță pentru durerea lombară cronică

Într-un studiu recent publicat în revista Biomaterials, cercetătorii au dezvoltat o nouă terapie genică non-virală pentru a trata durerile discogene de spate (DBP) prin administrarea factorului de transcripție Forkhead Box F1 (FOXF1) folosind vezicule extracelulare proiectate (eEV) în discuri intervertebrale degenerative (IVD) in vivo.

Durerea lombară cronică (DL) este o problemă globală în creștere din cauza îmbătrânirii populației și a agravării problemelor legate de opioide. Tratamentele actuale includ ameliorarea pe termen scurt sau intervenții chirurgicale costisitoare, subliniind necesitatea unor terapii non-dependente și mai puțin invazive.

Abordările biologice actuale, inclusiv administrarea factorilor de creștere, terapia celulară și terapia genică virală, pot reduce degenerarea în modelele animale și umane. Cu toate acestea, aspecte precum efectele pe termen scurt, eficacitatea slabă pe termen lung și imunogenitatea și oncogenitatea inutile pot împiedica aplicarea directă a acestor abordări.

În acest studiu, cercetătorii au stabilit o terapie genică non-virală pentru degenerarea discului intervertebral (DIV) utilizând FOXF1-eEV.

Cercetătorii au transfectat fibroblaste embrionare primare de șoarece (PMEF) cu plasmide conținând FOXF1 sau pCMV6 ca martor și au caracterizat probele de eEV folosind testul de urmărire a nanoparticulelor (NTA).

Aceștia au evaluat încărcarea eficientă a încărcăturii moleculare în eEV-uri utilizând reacția cantitativă în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (qRT-PCR) și PCR convențional. Analiza Western blot a identificat proteinele FOXF1 și specifice EV-urilor în formațiunile de eEV. Echipa a utilizat plasmide care amplifică regiunile polilinker superioare și inferioare pentru a determina prezența ADN-ului plasmidic FOXF1 în celulele donatoare și a generat eEV-uri.

Ei au examinat ARNm de lungime completă produs din ADN plasmidic în eEV-uri și celule donatoare.

Cercetătorii au creat vezicule extracelulare cu factori de transcripție pentru a restabili funcția țesuturilor și a modifica răspunsurile la durere într-un model animal de DBP.

Aceștia au identificat VE-uri pentru transportul și distribuția FOXF1 în discurile intervertebrale deteriorate într-un model murin de durere dorsală discogenă pentru a determina inhibarea de către FOXF1 eEV a degenerării discului intervertebral.

Echipa a combinat testarea biomecanică a discurilor intervertebrale de șoarece cu imagistica, modificările matricei extracelulare (MEC) și răspunsurile la durere evaluate după 12 săptămâni pentru a confirma modificările de structură și funcție, precum și durerea induse de intervenția terapeutică.

Evaluările preoperatorii și postoperatorii ale durerii au inclus tomografie microcomputerizată (micro-CT), imagistică prin rezonanță magnetică (IRM), testare mecanică, colorare cu albastru Alcian (AB) și roșu picrosirius (PSR), testul cu albastru de dimetilmetilen și imunohistochimie (IHC).

Studiul a implicat o tehnică chirurgicală în care cercetătorii au administrat buprenorfină ER subcutanat la șoareci pentru a controla durerea postoperatorie.

Echipa a efectuat evaluări comportamentale înainte de operație și la fiecare două săptămâni, între patru și 12 săptămâni după operație, folosind o varietate de metode, inclusiv testul în câmp deschis, placa rece, suspensia cozii și suspensia cu sârmă.

Testul în câmp deschis a evaluat activitatea spontană a șoarecilor; testele cu plăci reci au măsurat hiperalgezia termică; testele de suspensie cu cozi au măsurat durerea axială; iar testele de suspensie cu sârmă au măsurat rezistența.

La douăsprezece săptămâni după operație, echipa a disecat coloana lombară a animalelor folosind trasarea nervilor și arterelor femurale pentru a identifica discurile intervertebrale dintre L4 și L5, L5 și L6 și L6 și S1 IVD. Aceștia au folosit IVD-ul L5/L6 pentru a evalua histologia și a determina conținutul de glicozaminoglicani (GAG).

Venele electroforetice FOXF1 au redus semnificativ răspunsurile la durere, restabilind în același timp structura și funcția discurilor in vitro, inclusiv îmbunătățirea înălțimii discului, a hidratării țesuturilor, a conținutului de proteoglicani și a proprietăților mecanice.

Studiul s-a concentrat pe eliberarea de eEV-uri încărcate cu FOXF1 din fibroblaste primare transfectate cu factorul de transcripție FOXF1. RT PCR cantitativă a arătat o creștere semnificativă a nivelurilor de transcript ARNm FOXF1 și a nivelurilor de ARNm FOXF1 transcris pe lungime completă în comparație cu celulele transfectate cu pCMV6.

Terapia cu FOXF1 eEV poate reduce răspunsurile la durere într-un model de puncție discală lombară la șoareci timp de până la 12 săptămâni. Șoarecii femele au prezentat timpi de convulsii mai lungi în grupul tratat cu FOXF1 decât în grupul cu leziuni, care au durat cel puțin 12 săptămâni după tratament.

Terapia cu FOXF1 eEV a îmbunătățit in vivo hidratarea și înălțimea țesuturilor IVD la animalele rănite și degenerative, menținând în același timp nivelurile de hidratare și intensitatea imaginii ponderate T2 a discului IVD.

Cu toate acestea, echipa a observat o reducere a înălțimii discului la animalele rănite și la animalele tratate cu pCMV6 eEV. Șoarecii tratați cu FOXF1 eEV nu au prezentat nicio reducere a înălțimii discului la 12 săptămâni după tratament. Sexul nu a afectat rezultatele funcționale.

VEV-urile FOXF1 au restaurat funcția mecanică a dispozitivelor IVD deteriorate și degenerate in vivo. Sub stres axial, VIV-urile tratate cu VEV-uri FOXF1 au prezentat o rigiditate NZ normalizată mai mare în comparație cu VIV-urile deteriorate.

În condiții de fluaj, diapozitivele invertate deteriorate au prezentat deplasări normalizate la fluaj crescute, indicând o scădere a rigidității elastice normalizate la fluaj.

Rezultatele arată că reducerea conținutului de GAG în diapozitivele intraventriculare deteriorate crește flexibilitatea mecanică, dar terapia cu eEV previne pierderea glicozaminoglicanilor și modificările ulterioare ale funcției mecanice.

EV-urile FOXF1 au indus modificări structurale și funcționale în IVD prin creșterea nivelurilor de proteoglicani și GAG.

Rezultatele studiului au arătat că celulele electrice electrice (eEV) încărcate cu factori de transcripție de dezvoltare pot trata bolile articulare dureroase, cum ar fi DBP, prin administrarea acestor factori de transcripție în articulațiile degenerative și dureroase prin disfuncție in vitro.

Această strategie poate ajuta la reducerea anomaliilor structurale și funcționale cauzate de boală și la reglarea răspunsurilor la durere într-un mod specific genului.

Cercetătorii au recomandat, de asemenea, utilizarea factorilor de transcripție de dezvoltare, cum ar fi FOXF1, pentru a schimba celulele NP degenerative într-o stare pro-anabolică in vivo. Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina eficacitatea sa terapeutică.