Celule stem și medicină plastică regenerativă

Astăzi, există puțini medici practicanți care nu știu despre dezvoltarea unei noi direcții în tratamentul celor mai grave boli, anterior incurabile prin medicina tradițională și alternativă. Vorbim despre medicina regenerativ-plastică, bazată pe utilizarea potențialului regenerativ al celulelor stem. În jurul direcției de dezvoltare au apărut discuții științifice fără precedent și un hype pseudo-științific, creat în mare parte datorită hiperbolelor informaționale ale World Wide Web-ului. Într-un timp foarte scurt, studiile de laborator privind capacitățile terapeutice ale celulelor stem au depășit limitele experimentului și au început să fie introduse activ în medicina practică, ceea ce a dat naștere la o serie de probleme de natură științifică, etică, religioasă, juridică și legislativă. Instituțiile statale și publice s-au dovedit în mod clar a fi nepregătite pentru viteza tranziției celulelor stem de la vasele Petri la sistemele de administrare intravenoasă, ceea ce nu este benefic nici pentru societate în ansamblu, nici pentru o anumită persoană suferindă. Nu este ușor de înțeles cantitatea inimaginabilă de informații despre capacitățile celulelor stem, atât cantitativ, cât și calitativ, nici măcar pentru specialiști (care nu există, deoarece fiecare încearcă să stăpânească singur noua tendință științifică), ca să nu mai vorbim de medicii care nu sunt implicați direct în medicina plastică regenerativă.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

De ce sunt necesare astfel de experimente și sunt ele necesare deloc?

La prima vedere, crearea himerelor interspecifice celulare este rodul fanteziei nestăpânite a unui om de știință fanatic care a uitat de bioetică. Cu toate acestea, această abordare a extins semnificativ cunoștințele noastre fundamentale despre embriogeneză, deoarece a făcut posibilă calcularea numărului de celule necesare pentru organogeneză (formarea ficatului, creierului, pielii și organelor sistemului imunitar). În plus (poate acesta este principalul lucru în biologia ESC), geneticienii au primit la dispoziție un instrument unic, cu ajutorul căruia se poate stabili scopul funcțional al genelor în timpul himerizării embrionilor. Mai întâi, se folosește o tehnică specială de dublă eliminare pentru a „dezactiva” perechea de gene studiată în ESC. Apoi, astfel de ESC sunt introduse într-un blastocist și se monitorizează modificările care apar în corpul embrionului himeric în curs de dezvoltare. În acest fel, au fost stabilite funcțiile genelor sf-1 (dezvoltarea glandei suprarenale și a organelor genitale), urt-l (anlage-ul rinichilor), muoD (dezvoltarea mușchilor scheletici), gata-l-4 (anlage-ul eritropoiezei și limfopoiezei). În plus, gene umane care nu au fost încă studiate pot fi introduse (transfectate) în celulele stem embrionare ale animalelor de laborator pentru a le determina funcția folosind un embrion himeric.

Însă, de regulă, justificarea unui experiment prin obținerea de noi cunoștințe fundamentale nu găsește susținere din partea unui public larg. Să dăm un exemplu al semnificației aplicate a himerizării folosind ESC-uri. În primul rând, este vorba de xenotransplantare, adică transplantul de organe animale la oameni. Teoretic, crearea de himere celulare om-porc ne permite să obținem un animal mult mai apropiat ca caracteristici antigenice de donatorul de ESC, care în diverse situații clinice (diabet zaharat, ciroză hepatică) poate salva viața unei persoane bolnave. Este adevărat, pentru aceasta trebuie mai întâi să învățăm cum să redăm proprietatea de totipotență genomului unei celule somatice mature, după care aceasta poate fi introdusă într-un embrion de porc în curs de dezvoltare.

Astăzi, capacitatea celulelor stem embrionare (ESC) de a se diviza aproape infinit în condiții speciale de cultivare este utilizată pentru a produce masă celulară totipotentă cu diferențierea ulterioară a acesteia în celule specializate, cum ar fi neuronii dopaminergici, care sunt apoi transplantați la un pacient cu boala Parkinson. În acest caz, transplantul este în mod necesar precedat de diferențierea țintită a masei celulare obținute în celule specializate necesare pentru tratament și purificarea acestora din urmă din elemente celulare nediferențiate.

După cum s-a dovedit ulterior, amenințarea carcinogenezei a fost departe de a fi singurul obstacol în calea transplantului de celule. Spontan, celulele stem embrionare (ESC) se diferențiază eterogen, adică formează derivați dintr-o mare varietate de linii celulare (neuroni, keratinocite, fibroblaste, endoteliocite). În câmpul vizual al microscopului, în acest caz, cardiomiocitele ies în evidență printre celulele cu diverse fenotipuri, fiecare contractându-se în ritmul propriu. Cu toate acestea, pentru a trata un pacient, este necesar să existe populații celulare pure: neuroni - în caz de accident vascular cerebral, cardiomiocite - în caz de infarct miocardic, celule β ale pancreasului - în caz de diabet zaharat, keratinocite - în caz de arsuri etc.

Următoarea etapă în dezvoltarea transplantologiei celulare a fost asociată cu dezvoltarea tehnologiilor pentru obținerea unui număr suficient (milioane de celule) de astfel de populații de celule pure. Căutarea factorilor care cauzează diferențierea direcționată a ESC a fost de natură empirică, deoarece secvența sintezei lor în timpul embriogenezei a rămas necunoscută. Inițial, s-a stabilit că formarea sacului vitelin este indusă prin adăugarea de cAMP și acid retinoic la cultura ESC. Liniile celulare hematopoietice au fost formate în prezența 1L-3, SCF, factorului de creștere a fibroblastelor (FGH), factorului de creștere asemănător insulinei (IGF-1), 1L-6 și factorului de stimulare a coloniilor de granulocite (G-СSF) în mediul de cultură. Celulele sistemului nervos au fost formate din ESC după îndepărtarea LIF și a stratului de fibroblaste, care a servit drept hrănitor. După tratamentul cu acid retinoic în prezența serului fetal, ESC au început să se diferențieze în neuroni, iar cardiomiocitele au fost obținute prin adăugarea de dimetilsulfoxid (DMSO), care asigură livrarea direcționată a moleculelor de semnalizare hidrofobe către nucleul celular. În acest caz, acumularea de specii de oxigen activ în mediul de cultură, precum și stimularea electrică, au contribuit la formarea cardiomiocitelor contractile mature.

S-au depus eforturi și resurse enorme pentru a găsi condiții pentru diferențierea celulelor stem embrionare (CSE) în celule pancreatice producătoare de insulină. Cu toate acestea, a devenit curând clar că o serie de linii celulare specializate (celule β pancreatice, celule imune și endocrine, adipocite) nu apar din CSE atunci când sunt stimulate conform principiului „un factor stimulator - o linie celulară”. Acest principiu s-a dovedit a fi valabil doar pentru un număr limitat de linii celulare. În special, formarea neuronilor poate fi indusă de acidul retinoic, linia celulară musculară - de factorul de creștere transformant β (TCP-β), liniile eritroide - 1L-6, linia mieloidă monocitară - 1L-3. Mai mult, efectele acestor factori asupra diferențierii CSE s-au dovedit a fi strict dependente de doză.

A început etapa căutării combinațiilor de factori de creștere care ar avansa ESC-urile către stadii ulterioare ale embriogenezei, cu formarea mezodermului (sursa cardiomiocitelor, mușchilor scheletici, epiteliului tubulilor renali, mieloeritropoiezei și celulelor musculare netede), ectodermului (epidermă, neuroni, retină) și endodermului (epiteliul intestinului subțire și glandele secretoare, pneumocite). Natura părea să-i oblige pe cercetători să avanseze pe calea embriogenezei, repetând etapele acesteia într-o placă Petri, fără a oferi posibilitatea de a obține imediat și ușor rezultatul dorit. Și astfel de combinații de factori de creștere au fost găsite. Activina A în combinație cu TGF-β s-a dovedit a fi un stimulator puternic al formării celulelor mezodermale din ESC-uri, blocând în același timp dezvoltarea endodermului și ectodermului. Acidul retinoic și o combinație de semnale ale proteinei morfogenetice a măduvei osoase (BMP-4) și factorului de creștere epidermal (EGF) activează formarea celulelor ecto- și mezodermale, oprind dezvoltarea endodermului. Se observă o creștere celulară intensivă a tuturor celor trei straturi germinale cu efectul simultan a doi factori asupra ESC - factorul de creștere a hepatocitelor (HGF) și factorul de creștere a celulelor nervoase.

Astfel, pentru a obține liniile celulare necesare, este necesar mai întâi să se transfere celulele stem embrionare în stadiul de formare a celulelor unui anumit strat germinativ, iar apoi să se selecteze o nouă combinație de factori de creștere capabili să inducă diferențierea dirijată a ecto-, mezo- și endodermului în celule specializate necesare transplantului la pacient. Numărul de combinații de factori de creștere de astăzi este de ordinul miilor, majoritatea fiind brevetate, unele nefiind deloc dezvăluite de companiile de biotehnologie.

A venit momentul să se purifice celulele obținute de impuritățile celulare nediferențiate. Celulele diferențiate în cultură au fost marcate cu markeri ai liniilor celulare mature și trecute printr-un sortator imunofenotipic cu laser de mare viteză. Fasciculul laser le-a găsit în fluxul celular general și le-a direcționat pe o cale separată. Animalele de laborator au fost primele care au primit materialul celular purificat obținut. A venit momentul să se evalueze eficacitatea utilizării derivaților de celule stem embrionare (ESC) pe modele de boli și procese patologice. Unul dintre astfel de modele a fost boala Parkinson experimentală, care este bine reprodusă la animale folosind compuși chimici care distrug neuronii dopaminergici. Deoarece boala la om se bazează pe o deficiență dobândită de neuroni dopaminergici, utilizarea terapiei celulare de înlocuire în acest caz a fost justificată patogenetic. La animalele cu hemiparkinsonism experimental, aproximativ jumătate dintre neuronii dopaminergici obținuți din ESC și introduși în structurile creierului au prins rădăcini. Acest lucru a fost suficient pentru a reduce semnificativ manifestările clinice ale bolii. Încercările de a restabili funcția structurilor SNC deteriorate în accidente vasculare cerebrale experimentale, leziuni și chiar rupturi ale măduvei spinării s-au dovedit destul de reușite.

Totuși, trebuie menționat că aproape toate cazurile de utilizare cu succes a derivaților ESC diferențiați pentru corectarea patologiei experimentale au fost efectuate în perioada acută a situației patologice simulate. Rezultatele tratamentului la distanță nu au fost la fel de reconfortante: după 8-16 luni, efectul pozitiv al transplantului de celule a dispărut sau a scăzut brusc. Motivele pentru aceasta sunt destul de clare. Diferențierea celulelor transplantate in vitro sau in loco morbi duce inevitabil la exprimarea markerilor celulari de extraneitate genetică, ceea ce provoacă un atac imun din partea organismului receptorului. Pentru a rezolva problema incompatibilității imunologice, s-a utilizat imunosupresia tradițională, în paralel cu care studiile clinice au început să realizeze potențialul transdiferențierii și corectării genetice a celulelor stem hematopoietice și mezenchimale autologe care nu provoacă un conflict imun.

Ce este medicina plastică regenerativă?

Evoluția a determinat două opțiuni principale pentru sfârșitul vieții unei celule - necroza și apoptoza, care la nivel tisular corespund proceselor de proliferare și regenerare. Proliferarea poate fi considerată un fel de sacrificiu, atunci când umplerea defectului de țesut deteriorat are loc datorită înlocuirii acestuia cu elemente ale țesutului conjunctiv: menținând integritatea structurală, organismul pierde parțial funcția organului afectat, ceea ce determină dezvoltarea ulterioară a unor reacții compensatorii cu hipertrofie sau hiperplazie a elementelor structurale și funcționale care rămân intacte. Durata perioadei de compensare depinde de volumul leziunilor structurale cauzate de factorii de alterare primară și secundară, după care, în marea majoritate a cazurilor, are loc decompensarea, o deteriorare bruscă a calității și reducerea duratei vieții umane. Regenerarea fiziologică asigură procese de remodelare, adică înlocuirea celulelor îmbătrânite și muribunde prin mecanismele morții celulare naturale (apoptoză) cu altele noi provenite din rezervele de celule stem ale organismului uman. Procesele de regenerare reparativă implică și resursele celulare ale spațiilor stemului, care, însă, sunt mobilizate în condiții patologice asociate cu boli sau leziuni tisulare, inițiind moartea celulară prin mecanisme de necroză.

Atenția deosebită a oamenilor de știință, medicilor, presei, televiziunii și publicului larg acordată problemei studierii biologiei celulelor stem embrionare (ESC) se datorează, în primul rând, potențialului ridicat al terapiei celulare sau, cum o numim noi, regenerativ-plastice. Dezvoltarea metodelor de tratare a celor mai severe boli umane (patologia degenerativă a sistemului nervos central, leziunile măduvei spinării și ale creierului, bolile Alzheimer și Parkinson, scleroza multiplă, infarctul miocardic, hipertensiunea arterială, diabetul zaharat, bolile autoimune și leucemia, bolile de arsuri și procesele neoplazice - o listă departe de a fi completă) se bazează pe proprietățile unice ale celulelor stem, care permit crearea de noi țesuturi pentru a înlocui, așa cum se credea anterior, zonele de țesut deteriorate ireversibil ale unui organism bolnav.

Progresul cercetării teoretice în biologia celulelor stem din ultimii 10 ani a fost realizat prin apariția spontană a unor domenii ale medicinei regenerativ-plastice emergente, a cărei metodologie nu numai că este destul de ușor de sistematizat, dar o și necesită. Prima și cea mai rapidă dezvoltare a domeniului de utilizare practică a potențialului regenerativ al celulelor stem a devenit terapia regenerativ-plastică de substituție. Calea sa este destul de ușor de urmărit în literatura științifică - de la experimentele pe animale cu necroză miocardică până la lucrările din ultimii ani care vizează restabilirea deficitului post-infarct de cardiomiocite sau compensarea pierderii de celule β ale pancreasului și neuroni dopaminergici ai sistemului nervos central.

Transplantul de celule

Baza medicinei regenerativ-plastice substitutive este transplantul de celule. Acesta din urmă ar trebui definit ca un complex de măsuri medicale, în timpul cărora organismul pacientului intră în contact direct cu celule viabile de origine auto-, alo-, izo- sau xenogenă pentru o perioadă scurtă sau lungă de timp. Mijlocul de transplant celular este o suspensie de celule stem sau derivate ale acestora, standardizată prin numărul de unități de transplant. O unitate de transplant reprezintă raportul dintre numărul de unități formatoare de colonii din cultură și numărul total de celule transplantate. Metode de transplant celular: administrarea intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată a unei suspensii de celule stem sau derivate ale acestora; administrarea unei suspensii de celule stem sau derivate ale acestora în ventriculele creierului, vasele limfatice sau lichidul cefalorahidian.

Transplantul de celule alogene și autologe utilizează două abordări metodologice fundamental diferite pentru implementarea potențialului pluri-, multi- sau polipotent al celulelor stem - in vivo sau in vitro. În primul caz, introducerea celulelor stem în corpul pacientului se realizează fără diferențierea lor prealabilă, în al doilea - după reproducerea în cultură, diferențierea țintită și purificarea din elementele nediferențiate. Printre numeroasele tehnici metodologice de terapie celulară de înlocuire, se disting destul de clar trei grupuri de metode: înlocuirea măduvei osoase și a celulelor sanguine, înlocuirea celulelor organelor și țesuturilor moi, înlocuirea elementelor rigide și solide ale corpului (cartilaj, os, tendoane, valve cardiace și vase capacitive). Ultima direcție ar trebui definită ca medicină reconstructivă și regenerativă, deoarece potențialul de diferențiere al celulelor stem este realizat pe o matrice - o structură biologic inertă sau absorbabilă, de formă asemănătoare zonei înlocuite a corpului.

O altă modalitate de a crește intensitatea proceselor regenerativ-plastice în țesuturile deteriorate este mobilizarea resurselor stem proprii ale pacientului prin utilizarea factorilor de creștere exogeni, cum ar fi factorii stimulatori ai coloniilor de granulocite și granulocite-macrofage. În acest caz, ruptura conexiunilor stromale duce la o creștere a eliberării celulelor stem hematopoietice în fluxul sanguin general, care în zona leziunilor tisulare asigură procese de regenerare datorită plasticității lor inerente.

Astfel, metodele medicinei regenerative au ca scop stimularea proceselor de restaurare a funcției pierdute - fie prin mobilizarea rezervelor proprii ale pacientului, fie prin introducerea de material celular alogen.

Un rezultat practic important al descoperirii celulelor stem embrionare este clonarea terapeutică bazată pe înțelegerea factorilor declanșatori ai embriogenezei. Dacă semnalul inițial pentru debutul embriogenezei este complexul pre-ARNm situat în citoplasma ovocitului, atunci introducerea nucleului oricărei celule somatice în ovulul enucleat ar trebui să declanșeze programul de dezvoltare a embrionului. Astăzi știm deja că aproximativ 15.000 de gene participă la implementarea programului de embriogeneză. Ce se întâmplă cu ele mai târziu, după naștere, în perioadele de creștere, maturitate și îmbătrânire? Răspunsul la această întrebare a fost dat de oaia Dolly: ele sunt conservate. Folosind cele mai moderne metode de cercetare, s-a dovedit că nucleele celulelor adulte păstrează toate codurile necesare pentru formarea celulelor stem embrionare, a straturilor germinale, a organogenezei și a maturării restrictive (ieșirea la diferențiere și specializare) a liniilor celulare de origine mezenchimală, ecto-, endo- și mezodermică. Clonarea terapeutică ca direcție a fost formată încă din primele etape ale dezvoltării transplantologiei celulare și prevede revenirea totipotenței celulelor somatice ale pacientului pentru a obține material de transplant identic genetic.

Descoperirea celulelor stem a început „de la sfârșit”, deoarece termenul introdus în biologie și medicină de A. Maksimov se referea la celulele stem din măduva osoasă, care dau naștere tuturor elementelor celulare mature ale sângelui periferic. Cu toate acestea, celulele stem hematopoietice, la fel ca celulele tuturor țesuturilor unui organism adult, au și ele propriul lor predecesor, mai puțin diferențiat. Sursa comună pentru absolut toate celulele somatice este celula stem embrionară. Trebuie menționat că conceptele de „celule stem embrionare” și „celule stem embrionare” nu sunt nicidecum identice. Celulele stem embrionare au fost izolate de J. Thomson din masa celulară internă a blastocistului și transferate în linii celulare cu viață lungă. Doar aceste celule au un facsimil al „CSE”. Leroy Stevens, care a descoperit celulele stem embrionare în experimente pe șoareci, le-a numit „celule stem pluripotente embrionare”, referindu-se la capacitatea CSE de a se diferenția în derivați ai tuturor celor trei straturi germinale (ecto-, mezo- și endoderm). Totuși, toate celulele embrionului aflate în stadii ulterioare de dezvoltare sunt, de asemenea, celule stem, deoarece dau naștere unui număr imens de celule care formează corpul unui adult. Pentru a le defini, propunem termenul de „celule progenitoare pluripotente embrionare”.

[ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Tipuri de celule stem

Clasificarea modernă a celulelor stem se bazează pe principiul diviziunii lor prin capacitatea (potența) de a da naștere la linii celulare, definită ca toti-, pluri-, multi-, poli-, bi- și unipotență. Totipotența, adică capacitatea de a recrea un organism programat genetic în ansamblu, este posedată de celulele zigote, blastomeri și celulele stem embrionare (celule ale masei interne a blastocistului). Un alt grup de celule totipotente, care se formează în stadii ulterioare ale dezvoltării embrionare, este reprezentat de celulele germinale primare ale zonei genitale embrionare (tuberculii genitali). Pluripotența, adică capacitatea de a se diferenția în celule ale oricărui organ sau țesut, este inerentă celulelor embrionare ale celor trei straturi germinale - ecto-, mezo- și endoderm. Se crede că multipotența, adică capacitatea de a forma orice celule în cadrul unei linii specializate, este caracteristică doar a două tipuri de celule: așa-numitele celule stem mezenchimale, care se formează în creasta neurală și sunt precursoarele tuturor celulelor bazei țesutului conjunctiv al corpului, inclusiv celulele neurogliale, precum și celulele stem hematopoietice hematopoietice, care dau naștere tuturor liniilor celulare sanguine. În plus, se disting celulele stem bi- și unipotente, în special celulele precursoare ale germenilor hematopoietici mieloizi, limfoizi, monocitari și megacariocitari. Existența celulelor stem unipotente a fost demonstrată clar folosind exemplul celulelor hepatice - pierderea unei părți semnificative a țesutului hepatic este compensată prin diviziunea intensivă a hepatocitelor poliploide diferențiate.

În timpul dezvoltării, toate organele și țesuturile se formează ca urmare a proliferării și diferențierii masei celulare interne a blastocistului, ale cărui celule sunt, în sens strict, celule stem embrionare totipotente. Primele lucrări privind izolarea celulelor stem embrionare au fost efectuate de Evans, care a arătat că blastocistele implantate în creierul șoarecilor dau naștere la teratocarcinoame, ale căror celule, atunci când sunt clonate, formează linii de celule stem embrionare pluripotente (denumirea originală a acestor celule - celule de carcinom embrionar sau în abrevierea ECС - nu este utilizată în prezent). Aceste date au fost confirmate într-o serie de alte studii în care celulele stem embrionare au fost obținute prin cultivarea celulelor blastocistelor de șoareci și alte specii de animale, precum și de oameni.

În ultimii ani, literatura de specialitate a raportat din ce în ce mai mult despre plasticitatea celulelor stem, considerată nu doar ca fiind capacitatea acestora din urmă de a se diferenția în diferite tipuri de celule în diferite stadii de dezvoltare, ci și de a suferi dediferențiere (transdiferențiere, retrodiferențiere). Adică, se admite posibilitatea fundamentală de a readuce o celulă diferențiată somatic la stadiul de dezvoltare embrionară cu recapitularea (revenirea) pluripotenței și implementarea acesteia în diferențierea repetată cu formarea de celule de un tip diferit. În special, se raportează că celulele stem hematopoietice sunt capabile de transdiferențiere cu formarea de hepatocite, cardiomioblaste și endoteliocite.

Dezbaterile științifice privind diviziunea celulelor stem în funcție de plasticitatea lor continuă, adică terminologia și glosarul transplantului de celule sunt în curs de formare, ceea ce are o semnificație practică directă, deoarece majoritatea metodelor de medicină plastică regenerativă se bazează pe utilizarea proprietăților plastice și pe capacitatea celulelor stem de a se diferenția în diverse linii celulare.

Numărul publicațiilor în domeniul problemelor fundamentale și aplicate ale medicinei regenerativ-plastice este în creștere rapidă. A fost deja conturată o gamă de abordări metodologice diferite care vizează utilizarea cât mai optimă a potențialului regenerativ-plastic al celulelor stem. Cardiologi și endocrinologi, neurologi și neurochirurgi, transplantologi și hematologi și-au identificat domeniile de interes urgent. Oftalmologi, ftiziologi, pneumologi, nefrologi, oncologi, geneticieni, pediatri, gastroenterologi, terapeuți și pediatri, chirurgi și obstetricieni-ginecologi caută o soluție la problemele presante legate de capacitățile plastice ale celulelor stem - toți reprezentanții medicinei moderne speră să aibă oportunitatea de a vindeca boli care anterior erau considerate fatale.

Este transplantul de celule următorul „panaceu”?

Această întrebare se pune, pe bună dreptate, în rândul tuturor medicilor și oamenilor de știință atenți care analizează starea actuală a științei medicale. Situația este complicată de faptul că, de o parte a câmpului confruntării științifice se află „conservatorii sănătoși”, de cealaltă – „fanaticii bolnavi” ai transplantului de celule. Evident, adevărul, ca întotdeauna, se află între ei – în „țara nimănui”. Fără a atinge problemele de drept, etică, religie și moralitate, să luăm în considerare avantajele și dezavantajele domeniilor desemnate de medicina regenerativ-plastică. „Adierea ușoară” a primelor rapoarte științifice privind posibilitățile terapeutice ale celulelor stem embrionare s-a transformat într-un „vânt puternic” la un an de la descoperirea lor, care s-a transformat într-o „tornată informațională” în 2003. Prima serie de publicații s-a referit la problemele cultivării celulelor stem embrionare, reproducerii acestora și diferențierii dirijate in vitro.

S-a constatat că pentru reproducerea nelimitată a celulelor stem embrionare în cultură este necesară respectarea cu strictețe a unei serii de condiții. Trei factori trebuie să fie prezenți în mediul condiționat: interleukina-6 (IL-6), factorul celulelor stem (SCF) și factorul inhibitor al leucazei (LIF). În plus, celulele stem embrionare trebuie cultivate pe un substrat (strat hrănitor de celule) de fibroblaste embrionare și în prezența serului fetal de vițel. Dacă aceste condiții sunt îndeplinite, celulele stem embrionare (ESC) în cultură cresc ca clone și formează corpuri embrionare - agregate de clone în suspensie de celule sferice. Cea mai importantă caracteristică a clonei ESC este că, în cultură, corpul embrionar se oprește din creștere atunci când se acumulează 50-60, maximum 100 de celule în agregat. În această perioadă, apare o stare de echilibru - rata de diviziune celulară din interiorul clonei este egală cu rata de apoptoză (moarte celulară programată) la periferia sa. După atingerea unui astfel de echilibru dinamic, celulele periferice ale corpului embrionar suferă o diferențiere spontană (de obicei, cu formarea de fragmente endodermale ale sacului vitelin, angioblaste și endoteliocite) cu pierderea totipotenței. Prin urmare, pentru a obține o cantitate suficientă de masă celulară totipotentă, corpul embrionar trebuie dezagregat săptămânal cu transplantul de celule stem embrionare individuale într-un nou mediu nutritiv - un proces destul de laborios.

Descoperirea celulelor stem embrionare nu a răspuns la întrebarea ce anume și cum declanșează programele de embriogeneză criptate în ADN-ul zigotului. Rămâne neclar cum se desfășoară programul genomului în timpul vieții umane. În același timp, studiul celulelor stem embrionare a făcut posibilă dezvoltarea unui concept al mecanismelor de menținere a toti-, pluri- și multipotenței celulelor stem în timpul diviziunii lor. Principala caracteristică distinctivă a unei celule stem este capacitatea sa de autoreproducere. Aceasta înseamnă că o celulă stem, spre deosebire de o celulă diferențiată, se divide asimetric: una dintre celulele fiice dă naștere unei linii celulare specializate, iar a doua păstrează toti-, pluri- sau multipotența genomului. A rămas neclar de ce și cum are loc acest proces în cele mai timpurii etape ale embriogenezei, când masa celulară internă a blastocistului în diviziune este în întregime totipotentă, iar genomul ESC se află într-o stare latentă (adormită, inhibată). Dacă în timpul diviziunii unei celule obișnuite procesul de duplicare este în mod necesar precedat de activarea și exprimarea unui întreg complex de gene, atunci în timpul diviziunii ESC acest lucru nu se întâmplă. Răspunsul la întrebarea „de ce” a fost obținut după descoperirea ARNm preexistent (pre-ARNm) în celulele stem embrionare (ESC), dintre care unele sunt formate în celulele foliculare și sunt stocate în citoplasma ovulului și zigotului. A doua descoperire a răspuns la întrebarea „cum”: în ESC au fost găsite enzime speciale numite „editaze”. Editazele îndeplinesc trei funcții importante. În primul rând, ele oferă citire epigenetică alternativă (fără participarea genomului) și duplicare a pre-ARNm. În al doilea rând, ele implementează procesul de activare a pre-ARNm (splicing - tăierea intronilor, adică a secțiunilor inactive de ARN care inhibă procesul de sinteză a proteinelor pe ARNm), după care începe asamblarea moleculelor de proteine în celulă. În al treilea rând, editazele promovează formarea ARNm secundari, care sunt represori ai mecanismelor de expresie genică, ceea ce menține împachetarea densă a cromatinei și starea inactivă a genelor. Produșii proteici sintetizați pe astfel de ARNm secundari și numiți proteine silencer sau gardieni ai genomului sunt prezenți în ovulul uman.

Iată cum este prezentat astăzi mecanismul de formare a liniilor celulare nemuritoare ale celulelor stem embrionare. Simplu spus, semnalul pentru lansarea programului de embriogeneză, ale cărui etape inițiale constau în formarea masei celulare totipotente, provine din citoplasma ovulului. Dacă în această etapă masa celulară internă a blastocistului, adică ESC, este izolată de semnalele de reglare ulterioare, procesul de autoreproducere a celulelor are loc într-un ciclu închis, fără participarea genelor nucleului celular (epigenetic). Dacă o astfel de celulă este prevăzută cu material nutritiv și izolată de semnalele externe care promovează diferențierea masei celulare, aceasta se va diviza și reproduce propria specie la nesfârșit.

Primele rezultate ale încercărilor experimentale de utilizare a celulelor totipotente pentru transplant au fost destul de impresionante: introducerea celulelor stem embrionare în țesuturile șoarecilor cu un sistem imunitar slăbit de imunosupresoare a dus la dezvoltarea de tumori în 100% din cazuri. Printre celulele neoplasmului, a cărui sursă au fost ESC-urile, au existat derivați diferențiați ai materialului celular exogen totipotent, în special neuroni, dar creșterea teratocarcinoamelor a redus la zero valoarea rezultatelor obținute. În același timp, în lucrările lui L. Stevens, ESC-urile introduse în cavitatea abdominală au format agregate mari în care s-au format fragmentar mușchii embrionari, inima, părul, pielea, oasele, mușchii și țesutul nervos. (Chirurgii care au deschis chisturi dermoide ar trebui să fie familiarizați cu această imagine). Interesant este că celulele embrioblastice de șoarece suspendate se comportă exact în același mod: introducerea lor în țesuturile animalelor adulte imunocompromise provoacă întotdeauna formarea de teratocarcinoame. Dar dacă o linie pură de ESC este izolată dintr-o astfel de tumoare și introdusă în cavitatea abdominală, atunci se formează din nou derivate somatice specializate ale tuturor celor trei straturi germinale fără semne de carcinogeneză.

Astfel, următoarea problemă care trebuia rezolvată era purificarea materialului celular de impuritățile celulelor nediferențiate. Cu toate acestea, chiar și cu o eficiență foarte mare a diferențierii celulare țintite, până la 20% dintre celulele din cultură își păstrează potențialul totipotent, care in vivo, din păcate, se realizează în creșterea tumorii. O altă „praștie” a naturii - pe scara riscului medical, garanția recuperării pacientului se echilibrează cu garanția morții sale.

Relația dintre celulele tumorale și celulele progenitoare pluripotente embrionare (EPPC), care sunt mai avansate în dezvoltare decât celulele stem embrionare (ESC), este destul de ambiguă. Rezultatele studiilor noastre au arătat că introducerea EPPC în diverse tumori transplantabile la șobolani poate duce la dezintegrarea țesutului tumoral (G), la o creștere rapidă a masei tumorale (D), la reducerea acesteia (E-3) sau nu afectează dimensiunea necrozei focale centrale spontane a țesutului neoplastic (I, K). Este evident că rezultatul interacțiunii dintre EPPC și celulele tumorale este determinat de setul total de citokine și factori de creștere produși de acestea in vivo.

Este demn de remarcat faptul că celulele stem embrionare, care răspund cu carcinogeneză la contactul cu țesuturile adulte, sunt perfect asimilate cu masa celulară a embrionului, integrându-se în toate organele embrionului. Astfel de himere, constând din celulele proprii ale embrionului și celule stem stem donatoare, sunt numite animale alofene, deși, de fapt, nu sunt himere fenotipice. Sistemul hematopoietic, pielea, țesutul nervos, ficatul și intestinul subțire suferă o himerizare celulară maximă atunci când celulele stem stem sunt introduse într-un embrion timpuriu. Au fost descrise cazuri de himerizare a organelor genitale. Singura zonă inviolabilă pentru celulele stem stem sunt celulele germinale primare.

Adică, embrionul păstrează informația genetică a părinților săi, ceea ce protejează puritatea și continuarea atât a genului, cât și a speciei.

În condiții de blocare a diviziunii celulare a embrionului timpuriu folosind citoclazină, introducerea celulelor stem embrionare în blastocist duce la dezvoltarea unui embrion ale cărui celule germinale primare, ca toate celelalte, s-au format din celule stem embrionare donatoare. Dar în acest caz, embrionul în sine este complet donator, genetic străin organismului mamei surogat. Mecanismele unui astfel de blocaj natural al potențialului de amestecare a informațiilor ereditare proprii cu cele străine nu au fost încă clarificate. Se poate presupune că în acest caz se realizează programul de apoptoză, a cărui determinantă nu ne este încă cunoscută.

Trebuie menționat că embriogeneza animalelor din diferite specii nu este niciodată coordonată: atunci când se implementează programul donator de organogeneză în corpul embrionului receptor de celule stem embrionare xenogene, embrionul moare in utero și este resorbit. Prin urmare, existența himerelor „șoarece-șoarece”, „vacă-porc”, „om-șobolan” trebuie înțeleasă ca mozaicism celular, dar nu morfologic. Cu alte cuvinte, atunci când celulele stem stem ale unei specii de mamifer sunt introduse în blastocistul altei specii, se dezvoltă întotdeauna urmași ai speciei materne, în care, printre celulele proprii ale aproape tuturor organelor, se găsesc incluziuni și uneori grupuri de unități structurale și funcționale constând din material genetic străin derivat din celule stem stem. Termenul „porc umanizat” nu poate fi perceput ca o denumire a unui monstru înzestrat cu inteligență sau caracteristici externe umane. Acesta este doar un animal, o parte din corpul căruia celulele provin din celule stem stem umane introduse în blastocistul unui porc.

Perspective pentru utilizarea celulelor stem

Se știe de mult timp că bolile asociate cu genopatologia celulelor hematopoietice și limfoide sunt adesea eliminate după transplantul alogen de măduvă osoasă. Înlocuirea propriului țesut hematopoietic cu celule genetic normale de la un donator înrudit duce la recuperarea parțială și uneori completă a pacientului. Printre bolile genetice care sunt tratate cu transplant alogen de măduvă osoasă, merită menționat sindromul imunodeficienței combinate, agamaglobulinemia legată de X, granulomatoza cronică, sindromul Wiskott-Aldrich, bolile Gaucher și Hurler, adrenoleucodistrofia, leucodistrofia metacromatică, anemia falciformă, talasemia, anemia Fanconi și SIDA. Principala problemă în utilizarea transplantului alogen de măduvă osoasă în tratamentul acestor boli este asociată cu selecția unui donator înrudit compatibil cu HbA1c, pentru a cărui căutare cu succes sunt necesare în medie 100.000 de probe de țesut hematopoietic donator tipizat.

Terapia genică permite corectarea unui defect genetic direct în celulele stem hematopoietice ale pacientului. Teoretic, terapia genică oferă aceleași avantaje în tratamentul bolilor genetice ale sistemului hematopoietic ca și transplantul alogen de măduvă osoasă, dar fără toate complicațiile imunologice posibile. Cu toate acestea, aceasta necesită o tehnică care să permită transferul eficient al unei gene complete în celulele stem hematopoietice și menținerea nivelului necesar de expresie a acesteia, care în anumite tipuri de patologie ereditară poate să nu fie foarte ridicat. În acest caz, chiar și o ușoară refacere a produsului proteic al genei deficitare dă un efect clinic pozitiv. În special, în hemofilia B, 10-20% din nivelul normal de factor IX este suficient pentru a restabili mecanismul intern de coagulare a sângelui. Modificarea genetică a materialului celular autolog s-a dovedit a fi eficientă în hemiparkinsonismul experimental (distrugerea unilaterală a neuronilor dopaminergici). Transfecția fibroblastelor embrionare de șobolan cu un vector retroviral care conține gena tirozin hidroxilazei a asigurat sinteza dopaminei în sistemul nervos central: administrarea intracerebrală a fibroblastelor transfectate a redus drastic intensitatea manifestărilor clinice ale unui model experimental de boală Parkinson la animalele de experiment.

Perspectiva utilizării celulelor stem pentru terapia genică a bolilor umane a ridicat numeroase provocări noi pentru clinicieni și experimentatori. Aspectele problematice ale terapiei genice sunt asociate cu dezvoltarea unui sistem sigur și eficient pentru transportul genelor în celula țintă. În prezent, eficiența transferului de gene în celule mari de mamifere este foarte scăzută (1%). Metodic, această problemă este rezolvată în diverse moduri. Transferul de gene in vitro implică transfecția materialului genetic în celulele pacientului în cultură, cu returnarea ulterioară a acestora în corpul pacientului. Această abordare ar trebui recunoscută ca fiind optimă atunci când se utilizează gene introduse în celule stem din măduva osoasă, deoarece metodele de transfer al celulelor hematopoietice din organism în cultură și înapoi sunt bine stabilite. Retrovirusurile sunt cel mai adesea utilizate pentru transferul de gene în celule hematopoietice in vitro. Cu toate acestea, cea mai mare parte a celulelor stem hematopoietice se află într-o stare latentă, ceea ce complică transportul informațiilor genetice folosind retrovirusuri și necesită căutarea de noi modalități de transport eficient al genelor în celulele stem latente. În prezent, se utilizează metode de transfer genetic precum transfecția, microinjecția directă a ADN-ului în celule, lipofecția, electroporarea, „gunul genetic”, cuplarea mecanică folosind bile de sticlă, transfecția hepatocitelor cu cuplare a ADN-ului dependentă de receptor la asialoglicoproteină și introducerea transgenei prin aerosoli în celulele epiteliului alveolar al plămânilor. Eficiența transferului de ADN prin aceste metode este de 10,0-0,01%. Cu alte cuvinte, în funcție de metoda de introducere a informațiilor genetice, succesul poate fi așteptat la 10 pacienți din 100 sau la 1 pacient din 10.000 de pacienți. Este evident că o metodă eficientă și în același timp sigură de transfer al genelor terapeutice nu a fost încă dezvoltată.

O soluție fundamental diferită la problema respingerii materialului celular alogen în transplantul celular este utilizarea unor doze mari de celule progenitoare pluripotente embrionare pentru a obține efectul de reinstalare a sistemului de control al homeostaziei antigenului unui organism adult (efectul Kukharchuk-Radchenko-Sirman), a cărui esență constă în inducerea toleranței imunologice prin crearea unei noi baze de celule imunocompetente cu reprogramarea simultană a sistemului de control al homeostaziei antigenului. După introducerea unor doze mari de EPPC, acestea din urmă se fixează în țesuturile timusului și măduvei osoase. În timus, EPPC, sub influența unui micromediu specific, se diferențiază în celule dendritice, interdigitate și elemente epitelio-stromale. În timpul diferențierii EPPC în timusul receptorului, împreună cu moleculele proprii ale receptorului din complexul major de histocompatibilitate (MHC), se exprimă molecule MHC determinate genetic în celulele donatoare, adică se stabilește un standard dublu al moleculelor MHC, conform căruia se realizează selecția pozitivă și negativă a limfocitelor T.

Astfel, reînnoirea legăturii efectoare a sistemului imunitar al receptorului are loc prin mecanismele cunoscute de selecție pozitivă și negativă a limfocitelor T, dar prin dublul standard al moleculelor MHC - EPPC-urile receptorului și donatorului.

Reprogramarea sistemului imunitar folosind EPPC nu numai că permite transplantul de celule fără utilizarea ulterioară pe termen lung a imunosupresoarelor, dar deschide și perspective complet noi în tratamentul bolilor autoimune și oferă un punct de sprijin pentru dezvoltarea de noi idei despre procesul de îmbătrânire umană. Pentru a înțelege mecanismele îmbătrânirii, am propus o teorie a epuizării spațiilor stem ale corpului. Conform prevederii principale a acestei teorii, îmbătrânirea este o reducere permanentă a dimensiunii spațiilor stem ale corpului, care este înțeleasă ca un grup de celule stem regionale („adulte”) (celule stem mezenchimale, neuronale, hematopoietice, celule progenitoare ale pielii, tractului digestiv, epiteliului endocrin, celule pigmentare ale pliurilor ciliare etc.), care completează pierderile celulare ale țesutului corespunzător în procesul de remodelare a corpului. Remodelarea corpului este reînnoirea compoziției celulare a tuturor țesuturilor și organelor datorită celulelor spațiului stem, care continuă pe tot parcursul vieții unui organism multicelular. Numărul de celule din spațiile stem este determinat genetic, ceea ce determină dimensiunea limitată (potențialul proliferativ) al fiecărui spațiu stem. La rândul său, dimensiunea spațiilor stemului determină rata de îmbătrânire a organelor, țesuturilor și sistemelor individuale ale corpului. După epuizarea rezervelor celulare ale spațiilor stemului, intensitatea și rata de îmbătrânire a unui organism multicelular sunt determinate de mecanismele de îmbătrânire a celulelor somatice diferențiate în limita Hayflick.

Prin urmare, în stadiul ontogenezei postnatale, extinderea spațiilor stemului nu numai că poate crește semnificativ durata de viață, ci și poate îmbunătăți calitatea vieții prin restabilirea potențialului de remodelare al organismului. Extinderea spațiilor stemului poate fi realizată prin introducerea unor doze mari de celule progenitoare pluripotente embrionare alogene, cu condiția ca sistemul imunitar al receptorului să fie reprogramat simultan, ceea ce crește semnificativ durata de viață a șoarecilor vârstnici din experiment.

Teoria epuizării spațiului stem poate schimba ideile existente nu numai despre mecanismele îmbătrânirii, ci și despre boală, precum și consecințele tratamentului medicamentos al acesteia. În special, boala se poate dezvolta ca urmare a patologiei celulelor spațiului stem (oncopatologie). Epuizarea rezervei de celule stem mezenchimale perturbă procesele de remodelare a țesutului conjunctiv, ceea ce duce la apariția semnelor externe de îmbătrânire (riduri, flacciditate a pielii, celulită). Epuizarea rezervei de celule endoteliale din stem provoacă dezvoltarea hipertensiunii arteriale și a aterosclerozei. Dimensiunea inițial mică a spațiului stem al timusului determină involuția sa permanentă și precoce, legată de vârstă. Îmbătrânirea prematură este o consecință a scăderii patologice inițiale a dimensiunii tuturor spațiilor stem ale corpului. Stimularea medicamentoasă și non-medicamentoasă a rezervelor de celule stem îmbunătățește calitatea vieții prin reducerea duratei acesteia, deoarece reduce dimensiunea spațiilor stem. Eficiența scăzută a geroprotectorilor moderni se datorează efectului lor protector asupra celulelor somatice diferențiate în curs de îmbătrânire și nu asupra spațiilor stem ale corpului.

În concluzie, dorim să remarcăm încă o dată că medicina regenerativ-plastică reprezintă o nouă direcție în tratamentul bolilor umane, bazată pe utilizarea potențialului regenerativ-plastic al celulelor stem. În acest caz, plasticitatea este înțeleasă ca fiind capacitatea celulelor stem exogene sau endogene de a se implanta și de a da naștere la noi germeni celulari specializați în zonele de țesut deteriorate ale unui organism bolnav. Obiectul medicinei regenerativ-plastice îl reprezintă bolile umane fatale care în prezent sunt incurabile, patologia ereditară, bolile în care metodele medicinei tradiționale obțin doar un efect simptomatic, precum și defectele anatomice ale corpului, a căror restaurare este scopul chirurgiei regenerative reconstructive-plastice. În opinia noastră, este prea devreme să considerăm primele încercări de a recrea organe întregi și funcțional complete din celule stem ca o arie separată a medicinei practice. Subiectul medicinei regenerativ-plastice îl reprezintă celulele stem, care, în funcție de sursa lor de recepție, au un potențial regenerativ-plastic diferit. Metodologia medicinei regenerativ-plastice se bazează pe transplantul de celule stem sau derivate ale acestora.