Rolul enzimelor și citokinelor în patogeneza osteoartritei

În ultimii ani, o mare atenție a cercetătorilor s-a concentrat pe identificarea proteazelor responsabile de degradarea ECM-ului cartilajului articular în osteoartroză. Conform conceptelor moderne, metaloproteazele matriceale (MMP) joacă un rol important în patogeneza osteoartrozei. La pacienții cu osteoartroză, se detectează un nivel crescut a trei MMP - colagenaze, stromelizine și gelatinaze. Colagenaza este responsabilă de degradarea colagenului nativ, stromelizina - colagenul de tip IV, proteoglicanii și laminina, gelatinaza - pentru degradarea gelatinei, colagenelor de tip IV, Vh XI, elastinei. În plus, se presupune prezența unei alte enzime - agrecanaza, care are proprietățile MMP-urilor și este responsabilă de proteoliza agregatelor de proteoglicani cartilaginoși.

În cartilajul articular uman au fost identificate trei tipuri de colagenaze, ale căror niveluri sunt semnificativ crescute la pacienții cu osteoartrită: colagenaza-1 (MMP-1), colagenaza-2 (MMP-8) și colagenaza-3 (MMP-13). Coexistența a trei tipuri diferite de colagenaze în cartilajul articular sugerează că fiecare dintre ele joacă propriul rol specific. Într-adevăr, colagenazele-1 și -2 sunt localizate în principal în zona superficială și intermediară superioară a cartilajului articular, în timp ce colagenaza-3 se găsește în zona intermediară inferioară și în zona profundă. Mai mult, rezultatele studiului imunohistochimic au demonstrat că, pe măsură ce osteoartrita progresează, nivelul de colagenază-3 atinge un platou și chiar scade, în timp ce nivelul de colagenază-1 crește treptat. Există dovezi că, în osteoartrita, colagenaza-1 este implicată în principal în procesul inflamator din cartilajul articular, în timp ce colagenaza-3 este implicată în remodelarea țesuturilor. Colagenaza-3, exprimată în cartilajul pacienților cu osteoartrită, degradează colagenul de tip II mai intens decât colagenaza-1.

Dintre reprezentanții celui de-al doilea grup de metaloproteaze, trei au fost identificați și în stromelizina umană: stromelizina-1 (MMP-3), stromelizina-2 (MMP-10) și stromelizina-3 (MMP-11). Astăzi, se știe că doar stromelizina-1 este implicată în procesul patologic al osteoartrozei. Stromelizina-2 nu este detectată în membrana sinovială a pacienților cu osteoartroză, dar se găsește în cantități foarte mici în fibroblastele sinoviale ale pacienților cu poliartrită reumatoidă. Stromelizina-3 se găsește și în membrana sinovială a pacienților cu poliartrită reumatoidă, în apropierea fibroblastelor, în special în zonele de fibroză.

În grupul gelatinazelor din țesutul cartilajului uman, au fost identificate doar două: gelatinaza de 92 kD (gelatinaza B sau MMP-9) și gelatinaza de 72 kD (gelatinaza A sau MMP-2); la pacienții cu osteoartrită, se determină o creștere a nivelului de gelatinază de 92 kD.

Recent, a fost identificat un alt grup de MMP-uri localizate la suprafața membranelor celulare și numite MMP-uri de tip membranar (MMP-MT). Acest grup include patru enzime - MMP-MT1 - MMP-MT-4. Expresia MMP-MT a fost găsită în cartilajul articular uman. Deși MMP-MT-1 are proprietăți de colagenază, ambele enzime MMP-MT-1 și MMP-MT-2 sunt capabile să activeze gelatinaza-72 kDa și colagenaza-3. Rolul acestui grup de MMP-uri în patogeneza artrozei necesită clarificare.

Proteinazele sunt secretate sub formă de zimogen, care este activat de alte proteinaze sau compuși organici ai mercurului. Activitatea catalitică a MMP-urilor depinde de prezența zincului în zona activă a enzimei.

Activitatea biologică a MMP-urilor este controlată de TIMP-uri specifice. Până în prezent, au fost identificate trei tipuri de TIMP-uri care se găsesc în țesuturile articulare umane: TIMP-1–TIMP-3. Un al patrulea tip de TIMP a fost identificat și clonat, dar nu a fost încă detectat în țesuturile articulare umane. Aceste molecule se leagă specific de situsul activ al MMP-urilor, deși unele dintre ele sunt capabile să se lege de situsul activ al progelatinazei de 72 kD (TIMP-2, -3, -4) și al progelatinazei de 92 kD (TIMP-1 și -3). Dovezile sugerează că în OA există un dezechilibru între MMP-uri și TIMP-uri în cartilajul articular, rezultând o deficiență relativă de inhibitori, posibil datorată parțial unei creșteri a nivelului de MMP-uri active în țesut. TIMP-1 și -2 se găsesc în cartilajul articular și sunt sintetizate de condrocite. În osteoartroză, doar TIMP-ul de tip I este detectat în membrana sinovială și lichidul sinovial. TIMP-3 se găsește exclusiv în ECM. TIMP-4 are aproape 50% din secvența sa de aminoacizi în comun cu TIMP-2 și 38% cu TIMP-1. În alte celule țintă, TIMP-4 este responsabil pentru modularea activării progelatinazei de 72 kD pe suprafața celulei, indicând un rol important ca regulator specific țesutului al remodelării ECM.

Un alt mecanism de control al activității biologice a MMP-urilor este activarea lor fiziologică. Se crede că enzimele din familia serinei și cisteinei proteaze, cum ar fi AP/plasmina și respectiv catepsina B, sunt activatori fiziologici ai MMP-urilor. Niveluri crescute de urokinază (uAP) și plasmină au fost găsite în cartilajul articular al pacienților cu osteoartrită.

În ciuda faptului că în țesuturile articulare se găsesc mai multe tipuri de catepsine, catepsina-B este considerată cel mai probabil activator al MMP-urilor din cartilaj. În țesuturile articulare umane au fost găsiți inhibitori fiziologici ai proteazelor serină și cisteinică. Activitatea inhibitorului AP-1 (IAI-1), precum și a proteazelor cisteinice, este redusă la pacienții cu osteoartrită. Similar MMP/TIMP, dezechilibrul dintre proteazele serină și cisteinică și inhibitorii acestora poate explica activitatea crescută a MMP-urilor în cartilajul articular al pacienților cu osteoartrită. În plus, MMP-urile sunt capabile să se activeze reciproc. De exemplu, stromelizina-1 activează colagenaza-1, colagenaza-3 și gelatinaza de 92 kD; colagenaza-3 activează gelatinaza de 92 kD; MMP-MT activează colagenaza-3, iar gelatinaza-72 kDa potențează această activare; MMP-MT activează, de asemenea, gelatinaza de 72 kDa. Citokinele pot fi împărțite în trei grupe - distructive (inflamatorii), reglatoare (inclusiv antiinflamatorii) și anabolice (factori de creștere).

Tipuri de citokine (conform lui van den Berg WB et al)

Distructiv	Interleukina-1 TNF-α Factorul inhibitor al leucemiei Interleukina-17
Reglementare	Interleukina-4 Interleukina-10 Interleukina-13 Inhibitori enzimatici
Anabolic	Factorii de creștere asemănători insulinei TGF-β Proteine morfogenetice osoase Proteine morfogenetice derivate din cartilaj

Citokinele distructive, în special IL-1, induc o creștere a eliberării de proteaze și inhibă sinteza proteoglicanilor și colagenului de către condrocite. Citokinele reglatoare, în special IL-4 și -10, inhibă producția de IL-1, cresc producția antagonistului receptorului IL-1 (IL-1RA) și reduc nivelul de NO sintază în condrocite. Astfel, IL-4 contracarează IL-1 în trei direcții: 1) reduce producția, prevenind efectele acesteia, 2) crește producția principalului „captator” IL-1RA și 3) reduce producția principalului „mesager” secundar NO. În plus, IL-4 reduce degradarea enzimatică a țesuturilor. In vivo, efectul terapeutic optim se obține cu o combinație de IL-4 și IL-10. Factorii anabolici precum TGF-β și IGF-1 nu interferează de fapt cu producerea sau acțiunea IL-1, ci prezintă activitatea opusă, de exemplu, stimulând sinteza proteoglicanilor și colagenului, suprimând activitatea proteazelor, iar TGF-β inhibă, de asemenea, eliberarea enzimelor și stimulează inhibitorii acestora.

Citokinele proinflamatorii sunt responsabile pentru creșterea sintezei și expresiei MMP-urilor în țesuturile articulare. Acestea sunt sintetizate în membrana sinovială și apoi difuzează în cartilajul articular prin lichidul sinovial. Citokinele proinflamatorii activează condrocitele, care la rândul lor sunt capabile să producă citokine proinflamatorii. În articulațiile afectate de osteoartroză, rolul de efector al inflamației este jucat în principal de celulele membranei sinoviale. Sinovocitele de tip macrofag secretă proteaze și mediatori inflamatori. Printre acestea, IL-f, TNF-a, IL-6, factorul inhibitor al leucemiei (LIF) și IL-17 sunt cele mai „implicate” în patogeneza osteoartrozei.

Substanțe biologic active care stimulează degradarea cartilajului articular în osteoartrita

• Interleukina-1
• Interleukina-3
• Interleukina-4
• TNF-α
• Factorii stimulatori ai coloniilor: macrofage (monocite) și granulocite-macrofage
• Substanța P
• PGE ₂
• Activatori de plasminogen (tipuri tisulare și urokinaze) și plasmină
• Metaloproteaze (colagenaze, elastaze, stromelizine)
• Catepsinele A și B
• Trilsin
• Lipopolisaharide bacteriene
• Fosfolipază Ag

Datele din literatura de specialitate indică faptul că IL-1 și, posibil, TNF-α sunt principalii mediatori ai distrugerii țesutului articular în osteoartroză. Cu toate acestea, încă nu se știe dacă acționează independent unul de celălalt sau dacă există o ierarhie funcțională între ei. Modelele animale de osteoartroză au arătat că blocarea IL-1 previne eficient distrugerea cartilajului articular, în timp ce blocarea TNF-α duce doar la o scădere a inflamației în țesuturile articulare. Concentrații crescute ale ambelor citokine au fost găsite în membrana sinovială, lichidul sinovial și cartilajul pacienților. În condrocite, acestea sunt capabile să crească sinteza nu numai a proteazelor (în principal MMP și AP), ci și a colagenilor minori, cum ar fi cei de tip I și III, și să reducă sinteza colagenilor de tip II și IX și a proteoglicanilor. Aceste citokine stimulează, de asemenea, speciile reactive de oxigen și mediatorii inflamatori, cum ar fi PGE2 _. Rezultatul unor astfel de modificări macromoleculare în cartilajul articular în osteoartrită este ineficiența proceselor reparative, ceea ce duce la o degradare suplimentară a cartilajului.

Citokinele proinflamatorii menționate mai sus modulează procesele de supresie/activare a MMP în osteoartroză. De exemplu, dezechilibrul dintre nivelurile de TIMP-1 și MMP din cartilaj în osteoartroză poate fi mediat de IL-1, deoarece un studiu in vitro a demonstrat că o creștere a concentrațiilor de IL-1 beta duce la o scădere a concentrațiilor de TIMP-1 și la o creștere a sintezei de MMP de către condrocite. Sinteza AP este, de asemenea, modulată de IL-1 beta. Stimularea in vitro a condrocitelor cartilajului articular cu IL-1 determină o creștere dependentă de doză a sintezei AP și o scădere bruscă a sintezei iAP-1. Capacitatea IL-1 de a reduce sinteza iAP-1 și de a stimula sinteza AP este un mecanism puternic pentru generarea plasminei și activarea MMP. În plus, plasmina nu este doar o enzimă care activează alte enzime, ci participă și la procesul de degradare a cartilajului prin proteoliză directă.

IL-ip este sintetizat ca un precursor inactiv cu o masă de 31 kD (pre-IL-ip), iar apoi, după scindarea peptidei semnal, este convertit într-o citokină activă cu o masă de 17,5 kD. În țesuturile articulare, inclusiv membrana sinovială, lichidul sinovial și cartilajul articular, IL-ip se găsește într-o formă activă, iar studiile in vivo au demonstrat capacitatea membranei sinoviale în osteoartroză de a secreta această citokină. Unele proteaze serice sunt capabile să convertească pre-IL-ip în forma sa bioactivă. La mamifere, astfel de proprietăți au fost găsite la o singură protează, care aparține familiei de enzime specifice aspartatului de cisteină și se numește enzimă de conversie a IL-1β (ICF sau caspază-1). Această enzimă este capabilă să convertească specific pre-IL-ip în IL-ip „matur” biologic activ, cu o masă de 17,5 kD. ICF este o proenzimă de 45 kD (p45) localizată în membrana celulară. După scindarea proteolitică a proenzimei p45, se formează două subunități cunoscute sub numele de p10 și p20, care sunt caracterizate prin activitate enzimatică.

TNF-a este sintetizat și ca precursor legat de membrană, cu o masă de 26 kDa; prin scindare proteolitică este eliberat din celulă sub formă activă solubilă, cu o masă de 17 kDa. Scindarea proteolitică este realizată de enzima de conversie a TNF-a (TNF-AC), care aparține familiei adamalizinelor. AR Amin și colab. (1997) au descoperit o expresie crescută a ARNm-ului TNF-AC în cartilajul articular al pacienților cu osteoartrită.

Activarea biologică a condrocitelor și sinovocitelor de către IL-1 și TNF-α este mediată prin legarea la receptori specifici de pe suprafața celulară - IL-R și TNF-R. Două tipuri de receptori au fost identificate pentru fiecare citokină - IL-IP tip I și II și TNF-R tip I (p55) și II (p75). IL-1PI și p55 sunt responsabile pentru transmiterea semnalului în celulele țesutului articular. IL-1R tip I are o afinitate puțin mai mare pentru IL-1beta decât pentru IL-1a; IL-1R tip II, dimpotrivă, are o afinitate mai mare pentru IL-1a decât pentru IL-ip. Rămâne neclar dacă IL-IP tip II poate media semnalele IL-1 sau servește doar pentru inhibarea competitivă a asocierii IL-1 cu IL-1R tip I. Condroitidele și fibroblastele sinoviale ale pacienților cu osteoartroză conțin cantități mari de IL-1PI și p55, ceea ce explică, la rândul său, sensibilitatea ridicată a acestor celule la stimularea de către citokinele corespunzătoare. Acest proces duce atât la creșterea secreției de enzime proteolitice, cât și la distrugerea cartilajului articular.

Implicarea IL-6 în procesul patologic al osteoartritei nu poate fi exclusă. Această presupunere se bazează pe următoarele observații:

• IL-6 crește numărul de celule inflamatorii din membrana sinovială,
• IL-6 stimulează proliferarea condrocitelor,
• IL-6 amplifică efectele IL-1 în creșterea sintezei MMP și inhibarea sintezei proteoglicanilor.

Totuși, IL-6 este capabilă să inducă producția de TIMP-uri, dar nu afectează producția de MMP-uri, așa că se crede că această citokină este implicată în procesul de inhibare a degradării proteolitice a cartilajului articular, care se realizează printr-un mecanism de feedback.

Un alt membru al familiei IL-6 este LIF, o citokină produsă de condrocitele obținute de la pacienții cu osteoartroză ca răspuns la stimularea de către citokinele proinflamatorii IL-1p și TNF-a. LIF stimulează resorbția proteoglicanilor cartilajului, precum și sinteza MMP și producția de NO. Rolul acestei citokine în osteoartroză nu a fost pe deplin elucidat.

IL-17 este un homodimer de 20-30 kD cu un efect similar IL-1, dar mult mai puțin pronunțat. IL-17 stimulează sinteza și eliberarea unui număr de citokine proinflamatorii, inclusiv IL-1p, TNF-a, IL-6 și MMP în celulele țintă, cum ar fi macrofagele umane. În plus, IL-17 stimulează producția de NO de către condrocite. La fel ca LIF, rolul IL-17 în patogeneza OA a fost puțin studiat.

Radicalul liber anorganic NO joacă un rol important în degradarea cartilajului articular în artroză. Condrocitele izolate de la pacienții cu osteoartrită produc cantități mai mari de NO atât spontan, cât și după stimularea cu citokine proinflamatorii, comparativ cu celulele normale. Un conținut ridicat de NO a fost găsit în lichidul sinovial și serul pacienților cu osteoartrită - acesta este un rezultat al expresiei și sintezei crescute a NO sintazei induse (hNOC), enzima responsabilă de producerea de NO. Recent, ADN-ul hNOC specific condrocitelor a fost clonat și a fost determinată secvența de aminoacizi a enzimei. Secvența de aminoacizi indică o identitate de 50% și o similaritate de 70% cu hNOC specific endoteliului și țesutului nervos.

NO inhibă sinteza macromoleculelor din matrița extracelulară a cartilajului articular și stimulează sinteza MMP. Mai mult, o creștere a producției de NO este însoțită de o scădere a sintezei antagonistului IL-IP (IL-1RA) de către condrocite. Astfel, o creștere a nivelului de IL-1 și o scădere a IL-1RA duce la hiperstimularea NO în condrocite, ceea ce, la rândul său, duce la o degradare crescută a matricei cartilajului. Există rapoarte despre efectul terapeutic in vivo al unui inhibitor selectiv al hNOC asupra progresiei osteoartrozei experimentale.

Inhibitorii naturali ai citokinelor sunt capabili să împiedice în mod direct legarea citokinelor de receptorii membranei celulare, reducând activitatea lor proinflamatorie. Inhibitorii naturali ai citokinelor pot fi împărțiți în trei clase în funcție de modul lor de acțiune.

Prima clasă de inhibitori include antagoniști ai receptorilor care împiedică legarea ligandului la receptorul său prin competiția pentru situsul de legare. Până în prezent, un astfel de inhibitor a fost găsit doar pentru IL-1 - acesta este inhibitorul competitiv menționat mai sus al sistemului IL-1/ILIP, IL-1 PA. IL-1 PA blochează multe efecte observate în țesuturile articulare în osteoartrita, inclusiv sinteza prostaglandinelor de către celulele sinoviale, producerea de colagenază de către condrocite și degradarea oaselor moale ale cartilajului articular.

IL-1RA se găsește în diferite forme - una solubilă (rIL-1RA) și două intercelulare (μIL-lPAI și μIL-1RAP). Afinitatea formei solubile de IL-1RA este de 5 ori mai mare decât cea a formelor intercelulare. În ciuda cercetărilor științifice intense, funcția acesteia din urmă rămâne necunoscută. Experimentele in vitro au arătat că inhibarea activității IL-1beta necesită o concentrație de IL-1RA de 10-100 de ori mai mare decât în mod normal, în timp ce condițiile in vivo necesită o creștere de o mie de ori a concentrației de IL-1RA. Acest fapt poate explica parțial deficitul relativ de IL-1RA și excesul de IL-1 în sinoviala pacienților cu osteoartroză.

A doua clasă de inhibitori naturali ai citokinelor sunt receptorii solubili ai citokinelor. Exemple de astfel de inhibitori la om, care sunt legați de patogeneza osteoartritei, sunt rIL-1R și pp55. Receptorii solubili ai citokinelor sunt forme scurtate ale receptorilor normali; atunci când se leagă de citokine, împiedică legarea acestora de receptorii asociați membranei celulelor țintă, acționând prin mecanismul antagonismului competitiv.

Principalul precursor al receptorilor solubili este IL-1RP legat de membrană. Afinitatea rIL-IP pentru IL-1 și IL-1RA este diferită. Astfel, rIL-1RN are o afinitate mai mare pentru IL-1β decât pentru IL-1RA, iar rIL-1PI prezintă o afinitate mai mare pentru IL-1RA decât pentru IL-ip.

Există, de asemenea, două tipuri de receptori solubili pentru TNF - pp55 și pp75, la fel ca receptorii solubili pentru IL-1, aceștia se formează prin „descărcare”. In vivo, ambii receptori se găsesc în țesuturile articulațiilor afectate. Rolul receptorilor solubili pentru TNF în patogeneza osteoartrozei este dezbătut. Se presupune că în concentrații scăzute, aceștia stabilizează structura tridimensională a TNF și cresc timpul de înjumătățire al citokinei bioactive, în timp ce concentrațiile mari de pp55 și pp75 pot reduce activitatea TNF prin antagonism competitiv. Probabil, pp75 poate acționa ca un purtător de TNF, facilitând legarea acestuia la receptorul asociat membranei.

A treia clasă de inhibitori naturali ai citokinelor este reprezentată de un grup de citokine antiinflamatorii, care includ TGF-beta, IL-4, IL-10 și IL-13. Citokinele antiinflamatorii reduc producția de pro-inflamatorii și a unor proteaze și stimulează producția de IL-1RA și TIMP.