Lucrări experimentale privind transplantul de keratinocite alogene pe cicatrici create artificial la șobolani albi

Dorința de a utiliza potențialul celular și nevoia de a găsi noi metode eficiente pentru îmbunătățirea aspectului estetic al cicatricilor au condus la ideea de a încerca să studieze posibilitatea transplantării keratinocitelor pe suprafețele cicatricilor.

Pentru a demonstra probabilitatea utilizării culturilor de keratinocite pentru îmbunătățirea aspectului cicatricilor, a fost efectuat un studiu experimental pe șobolani albi de laborator, cărora li s-au creat suprafețe cicatriciale. Modelul cicatricei de șobolan a fost obținut ca urmare a vindecării rănilor provocate artificial pe spate, de-a lungul coloanei vertebrale. Șobolanilor li s-au decupat bucăți identice de piele, cu dimensiunea de 2x3 cm. La 2,5 luni după operația de „modelare a cicatricilor”, șobolanii au fost supuși dermabraziunii (îndepărtarea straturilor superioare ale cicatricei folosind termocaustică) și li s-au transplantat keratinocite alogene, izolate de pe pielea puilor de șobolan la 2-4 zile după naștere.

Izolarea și cultivarea celulelor epidermice de șobolan au fost efectuate în laboratorul de tehnologii celulare al Institutului de Citologie al Academiei Ruse de Științe folosind următoarea tehnologie.

Pielea a fost spălată în soluție salină Hank conținând 200 U/ml gentamicină și tăiată în bucăți mici, cu o suprafață de 0,2-0,5 cm2 ^. Bucățile de piele au fost incubate în soluție de dispază 0,5% în soluție echilibrată tamponată cu fosfat salin la 37°C timp de 1 oră. Bucățile au fost apoi transferate în soluție salină tamponată cu fosfat Dulbecco, iar epiderma a fost separată de derm. Epiderma a fost incubată în soluție de tripsină 0,125% timp de 10-15 minute sub agitare la 50 rpm, după care acțiunea enzimatică a fost oprită prin adăugarea a 5% ser fetal bovin. O treime din suspensia celulară rezultată a fost utilizată în formă pură pentru una dintre opțiunile de transplant pe cicatrici, a doua treime a fost crescută pe pelicule biocompatibile de uz casnic „Polypor”, iar a treia - pe plăci Petri fără substrat. Operația de dermabraziune a cicatricilor rezultate la șobolani, cu transplantare ulterioară de celule epidermice de șobolan pe acestea, a fost efectuată sub anestezie eterică, utilizând un cauter termic.

În primul grup de șobolani, după dermabraziune, bucăți sterile de cambric au fost plasate pe suprafața lustruită, spălată cu soluție fiziologică și uscată a cicatricei, pe care s-a aplicat o suspensie agitată de epidermocite alogene de șobolan la o concentrație de 1,5 milioane de celule la 1 ml (conform Institutului de Citologie). Bucățile de cambric au fost plasate pe cicatricea lustruită astfel încât celulele să se așeze pe suprafața cicatricei. Deasupra a fost plasat un bandaj din mai multe straturi de tifon, care a fost cusut la marginile cicatricei.

O parte din suspensia celulară obținută a fost însămânțată în vase Petri pe pelicule sterile Polypore decupate la forma vasei, cealaltă parte - pe vase Petri fără peliculă. Cultivarea a fost efectuată în mediu FAD, constând dintr-un amestec de DMEM și mediu F12 într-un raport de 3:1, cu adaos de 10% ser fetal bovin, 5 μg/ml insulină (Sigma), 0,5 μg/ml hemisuccinat de hidrocortizon (Sigma) și 10 μg/ml factor de creștere epidermală EGF (Institutul de Citologie RAS, Sankt Petersburg). Al doilea și al treilea grup de șobolani, câte 7 indivizi fiecare, au fost operați la 6 zile după primul. În acest moment, din suspensia de keratinocite însămânțate în vase Petri s-au format straturi multistrat, care au fost transplantate la șobolani. Al doilea grup a fost transplantat cu epidermocite pe o peliculă, iar al treilea - cu un strat multistrat fără substrat. După 7 zile, straturile multistrat de keratinocite alogene (MPALK) obținute, însămânțate pe peliculele „Polypore”, au fost transplantate sub formă de cultură direct pe suprafața plăgii. Deasupra, pelicula, pentru a evita ruperea acesteia, a fost fixată cu un bandaj multistrat de tifon și cusută pe pielea șobolanilor.

Înainte de transplantarea keratinocitelor la al treilea grup de șobolani crescuți fără substrat, PAC a fost separat de fundul plăcii Petri prin tratarea acestuia cu dispază, care are capacitatea de a perturba selectiv legăturile dermo-epidermice. Atunci când acționează asupra unui strat multistrat, dispază perturbă conexiunea celulelor stratului bazal cu fundul plăcii Petri și are un efect mult mai mic asupra conexiunilor intercelulare, ceea ce face posibilă „îndepărtarea” completă a stratului. Desprinderea stratului celular multistrat cu dispază s-a efectuat după cum urmează. Mediul de transport a fost drenat din plăcile Petri, straturile celulare au fost spălate de trei ori cu un mediu nutritiv care conține antibiotice, în special gentamicină (0,2 mg/ml). Straturile multistrat au fost umplute cu soluție de dispază 0,125% („Sigma”) și plasate într-un termostat, unde au fost incubate la t=37°C timp de 20-30 de minute. Apariția unei margini albe care se desprinde de-a lungul periferiei stratului este un indicator al începerii procesului de separare a acestuia de marginile și fundul cutiei Petri. La câteva minute după începerea procesului de separare, soluția de dispază a fost drenată, straturile epiteliale fiind spălate de 2-3 ori cu mediu. Pe suprafața stratului epidermal s-a aplicat o bucată de pansament steril pentru răni „Lita-color”, tăiată la dimensiunea cupei, pe care s-a lipit stratul separat prin dispază, decojit suplimentar de pe fundul cupei cu o spatulă. Folosind o pensetă, stratul, împreună cu învelișul șervețelului „Lita-color” (Rusia), a fost rupt de pe fundul cutiei Petri și transferat cu grijă pe suprafața pregătită a cicatricei. Șervețelele „Lita-color” conțin gentamicină și exolină (extract de colagen), care, umezite cu resturile mediului de creștere și apoi cu o soluție fiziologică, s-au umflat și au devenit un pansament modern pentru răni, oferind o bună protecție împotriva infecțiilor externe și o vindecare rapidă datorită structurii care absoarbe umiditatea.

Bandaje de tifon multistrat au fost aplicate pe peliculele Polypore și șervețelele Lita-color și cusute pe pielea șobolanilor pentru o fixare mai puternică. Fiecare șobolan a fost plasat într-o cușcă separată pentru a crea condiții optime pentru menținerea și grefarea keratinocitelor transplantate. Bandajele șobolanilor cărora li s-a transplantat suspensia și stratul multistrat de epidermocite îndepărtate prin dispază au fost umezite cu soluție salină sterilă de mai multe ori pe zi pentru a crea cele mai favorabile condiții pentru grefarea celulelor. Având în vedere că pelicula Polypore era impermeabilă la apă, bandajele șobolanilor din al doilea grup nu au fost umezite, ceea ce a fost unul dintre avantajele față de transplanturile fără pelicule. Bandajele au fost îndepărtate după 10 zile. Tabloul clinic al cicatricilor după transplantul de celule a diferit puțin de cicatricile fără transplant, cu excepția culorii lor mai roz (datorată dermabraziunii) și a descuamării mai mari. Acest fapt sugerează că, imediat după ce pansamentele pentru răni au căzut odată cu MPC, nu au apărut modificări ale cicatricii.

Prelevarea de material bioptic de la șobolani.

După 1, 2, 5 și 9 luni de la transplantul de keratinocite alogene de șobolan pe cicatrici șlefuite de șobolani albi, s-a prelevat material pentru examinare histologică, citomorfologică și microscopică electronică. Au fost prelevate probe de piele normală de șobolan și cicatrice fără transplant de celule ca martor. Anestezia șobolanilor a fost efectuată folosind anestezie eterică.

După anestezie, s-au prelevat bucăți de țesut cicatricial din zonele marcate în care au fost transplantate keratinocitele folosind un punch de biopsie cu diametrul de 2 mm și s-au plasat într-o soluție de glutaraldehidă 2,5% pentru a pregăti materialul pentru examinare la microscop electronic. Bucățile de țesut prelevate pentru examinare histologică au fost plasate într-o soluție de formalină neutră 10%, urmată de trecerea prin alcooli și încorporarea în parafină, urmată de tăierea unor secțiuni ultra-subțiri și vizualizarea lor la un microscop optic-luminos.

Control I. Piele normală de șobolan.

Pentru a observa diferența dintre imaginea microscopică a pielii normale de șobolan cu modificări cicatriciale și cicatricile observate în anumite momente după transplantul de MPC, sunt prezentate fotografii și descrieri ale acestora în toate etapele acestui studiu.

Epiderma pielii normale este formată din 7-9 straturi de celule. Stratul cornos are o grosime moderată. În unele locuri este alcătuit din 6-8 straturi de solzi cornoși. Stratul bazal este reprezentat de celule cilindrice cu nuclei mari, ușori, de formă regulată și mai mulți nucleoli. Conexiunile desmosomale dintre celule și cu membrana bazală sunt clar exprimate. Sub membrana bazală bine definită, care prezintă mici excrescențe în stratul subepidermal, paralel cu aceasta se află fascicule delicate de fibre de colagen și elastină, printre care se numără fibroblaste alungite și vase mici. În straturile mai profunde, fascicule de fibre de colagen și elastină se află în direcții diferite. Printre acestea se numără numeroase vase cu pereți subțiri de același calibru, elemente celulare (fibroblaste, mastocite, leucocite). Un număr mare de foliculi de păr, glande sebacee.

Control 2. Cicatrice de șobolan, în vârstă de 2 luni.

Tablou clinic. Cicatricile sunt de culoare roz pal, cu descuamare, cruste rămân pe alocuri. Suprafața lor a scăzut din cauza contracției fibrelor de colagen și a ajuns la aproximativ 3,0-3,5 cm ^. Anexele cutanate sunt absente.

Imagine microscopică. Epiderma este formată din 3-5 straturi de celule, pliate, reprezentate de celule bazale rotunjite, un rând de celule subulate, 1-2 rânduri de celule granulare cu granule de keratohialină în stratul superior, existând zone de edem intracelular. Stratul cornos este modificat inegal de la foarte subțire la îngroșat. Plierea cicatricilor se observă datorită (contracției) țesutului cicatricial. Pliurile pătrund până la stratul papilar și creează impresia de papilă. Granița dintre epidermă și dermă este o linie dreaptă. Membrana bazală nu este trasată peste tot. În partea inferioară a straturilor subepidermale și mai profunde există vase cu un perete gros, lax, multe sunt părăsite, cu stază. În jurul vaselor există o acumulare de macrofage, fibroblaste. Macrofagele înconjoară eritrocitele eliberate din capilare și le fagocitozează. În straturile mai superficiale există capilare mici. Sub epidermă, fibrele de colagen sunt situate lax. În stratul mai profund al cicatricei există fascicule grosiere de fibre de colagen, printre care există numeroase fibroblaste.

Cicatrice de șobolan la o lună după transplantul de keratinocite de șobolan.

Tablou clinic. Cicatricile sunt rozalii, suprafața lor a scăzut, în special în diametru, și este în medie de 2,5-3 cm² ^. Părul și glandele sebacee sunt absente.

Datele examinării microscopice a materialului obținut de la șobolani cu transplant de MPaLK pe film și MPaLK fără substrat sunt practic identice. Cu toate acestea, din punct de vedere pur tehnic, lucrul cu MPaLK fără substrat este mult mai complicat și mai minuțios decât atunci când se cultivă MPaLK pe substrat, prin urmare, în studierea ulterioară a problemei transplantului de keratinocite în cicatrici, am folosit cambric multistrat ca bază pentru creștere („substraturi”).

Imagine microscopică. Se observă îngroșarea epidermei la 15-20 de straturi, aproape până la mijlocul căreia keratinocitele au o formă îngustă, alungită, verticală și un aranjament compact. Celulele bazale sunt situate într-o linie neuniformă. Nucleii lor sunt ușori, mari, rotunjiți, cu unul sau doi nucleoli, ceea ce indică o activitate sintetică și proliferativă ridicată. Granița dintre epidermă și dermă este o linie dreaptă. Stratul spinos este bine dezvoltat, este format din 3-5 straturi de celule rotunjite, există 2 celule nucleolare.

Imediat sub membrana bazală există fascicule subțiri de fibre de colagen dens localizate, paralel cu acestea există un număr mare de vase deșertate, fibrele de colagen mai profunde sunt mai grosiere, colectate în fascicule dense. Numeroase fibroblaste mari, mastocite (2-3 în câmpul vizual), macrofage, leucocite și vase deșertate, ale căror pereți sunt slăbiți, în jurul lor există fibre de colagen localizate lax. În unele vase există stază, diapedeză a elementelor formate. În jurul vaselor există fibroblaste, limfocite individuale. Anexele pielii sunt absente.

La transplantarea unei suspensii de keratinocite pe o cicatrice lustruită, imaginea microscopică diferă de cea anterioară. La majoritatea animalelor, epiderma este subțire și constă din 5-6 straturi de celule. Stratul inferior este format din celule de formă neregulată, poligonală, cu nuclei de formă rotundă-neregulată. Starea stratului subepidermal este similară cu starea sa din grupul de animale fără transplant MPALK.

În acest caz, putem vorbi fie despre o întârziere a proceselor care însoțesc transplantul de celule, fie despre o pierdere mare de celule transplantate sub formă de suspensie. Prin urmare, s-a tras o concluzie despre inutilitatea corectării cicatricilor prin transplantul de keratinocite sub formă de suspensie.

Cicatrice de șobolan la 2 luni după transplantul de keratinocite de șobolan.

Tablou clinic. Cicatricea arată subțire și delicată. Pe alocuri se observă descuamare și pete descuamate.

Imagine microscopică. Stratul cornos este îngroșat, pe alocuri - hiperkeratoză. Epiderma este îngroșată, constă din 12-20 de rânduri de celule. Granița dintre epidermă și dermă este o linie dreaptă. Fibrele delicate de colagen de sub epidermă se află destul de dens. În straturile mai profunde ale cicatricii, acestea sunt colectate în fascicule mari și grosiere. În stratul subepidermal, apare o nouă formațiune vasculară. În straturile inferioare ale țesutului cicatricial, există numeroase vase deșertice situate paralel cu suprafața epidermei. Fibroblastele mari sunt distribuite uniform în grosimea cicatricii, există numeroase macrofage gigantice, multiramificate.

Cicatrice de șobolan la 5 luni după transplantul de celule epidermice de șobolan.

Tablou clinic. Cicatricea arată uniform, netedă, fără a se descuama, există fire de păr individuale, densitatea lor fiind mai mare la periferia cicatricilor, ceea ce indică o creștere marginală a foliculilor de păr în cicatrice și o nouă formare de foliculi de păr. Suprafața cicatricilor continuă să scadă.

Imagine microscopică. Epiderma este încă groasă (15-20 de straturi, în unele locuri până la 30), iar în straturile superioare este umplută cu granule de keratohialină. Membrana bazală este clar vizibilă. Sub ea, fibrele de colagen se află laxe. În straturile inferioare, colagenul este mai puternic și mai compact. Printre fasciculele de colagen există numeroase capilare. În straturile superioare, numărul vaselor abandonate a scăzut. Joncțiunea dintre epidermă și dermă este ușor ondulată. În unele locuri, există excrescențe epidermice profunde în țesutul cicatricial. Printre fibrele de colagen sunt vizibile vase nou formate. Apar foliculi de păr singulari și glandele sebacee.

Cicatrice de șobolan la 9 luni după transplantul de celule MPA epidermice de șobolan.

Tablou clinic. Cicatricile au devenit semnificativ mai mici ca dimensiuni în comparație cu perioadele anterioare, suprafața lor fiind în medie de aproximativ 1,5-2,0 cm² ^. Cicatricile sunt acoperite neuniform cu păr fin, în special la periferie. Persistă o ușoară descuamare a plăcilor fine.

Imagine microscopică.

Epiderma a devenit mai subțire, este reprezentată de 6-8 rânduri de celule, seamănă ca structură cu epiderma pielii normale de șobolan, doar densitatea celulară este cu 1 mm mai mare și sunt mai mici. Stratul bazal este format din celule mici, rotunde, cilindrice. Membrana bazală este bine exprimată, hemidesmosomii sunt clar vizibili. Se observă prezența excrescențelor epidermice în stratul subepidermic. Stratul papilar este exprimat pe întreaga lungime a cicatricei. Aceste fapte indică faptul că, până în acest moment, aderența keratinocitelor transplantate a devenit mult mai puternică cu țesuturile cicatriciale subiacente. Prin urmare, îngrijirea cicatricilor la persoanele cu transplant MPALK la 9 luni după transplantul MPC poate fi tradițională. Sub epidermă, fibrele de colagen sunt mai delicate decât în straturile profunde. Au apărut multe vase, în special cele superficiale. Pereții vaselor mai mari sunt îngroșați. Foliculii de păr și glandele sebacee sunt în cantități mari. Imaginea microscopică seamănă cu țesutul dermal.

Rezultatele lucrărilor experimentale și discutarea lor.

În cursul acestei lucrări, keratinocite în diferite forme au fost transplantate pe cicatrici de piele de șobolan create artificial după operația de dermabraziune - pe acoperiri de răni, ca suspensie pe cambric și ca strat multistrat fără substrat. Lucrarea a fost realizată cu scopul de a obține date morfologice privind efectul keratinocitelor alogene transplantate asupra cicatricilor, precum și de a determina opțiunile optime de transplant.

S-a constatat că toate cele trei metode de transplantare sunt fezabile, însă transplantarea MPAC fără substrat este o procedură care necesită foarte multă muncă, în timpul căreia MPAC poate fi deteriorat, ceea ce afectează rezultatele transplantului. Mai mult, această metodă de transplantare exclude lucrul pe suprafețe mari.

Transplantul de suspensie de keratinocite este o metodă mult mai rentabilă, nu necesită cultivarea celulară pe termen lung și este simplu în versiunea pe care o propunem, utilizând semifabricate sterile din cambric, ale căror dimensiuni corespund dimensiunii cicatricilor. Întârzierea efectului terapeutic la transplantarea unei suspensii celulare cu aproximativ o lună, comparativ cu MPC pe o acoperire a plăgii, nu este un punct semnificativ, având în vedere durata tratamentului de mai multe luni. Se știe că atunci când MPC este transplantat la pacienții cu arsuri, transformarea structurii pielii are loc treptat și pe parcursul mai multor ani. Transplantul de culturi de keratinocite pe acoperiri ale plăgii este cea mai convenabilă și promițătoare metodă, dar și semnificativ mai scumpă. În plus, în prezent necesită căutarea unor opțiuni de acoperire mai avansate, care ar trebui să fie flexibile, higroscopice, să aibă proprietăți bacteriostatice sau bactericide și să fie biologic neutre pentru celule. Filmul „Polypor” - o versiune intermediară a filmului de acoperire a plăgii din casă, în ciuda unor imperfecțiuni, ne-a permis să studiem în experiment transplantul de keratinocite de șobolan pe cicatrici și să tragem concluzii despre eficacitatea acestei direcții de tratament al cicatricilor.

Autorii care au transplantat keratinocite multistratificate pe arsuri au observat că, în prima săptămână după transplantarea unui strat multistratificat de keratinocite pe rănile dezinfectate, epiderma s-a îngroșat și s-a stratificat. Toate straturile epidermei erau clar vizibile. Interesant este că numărul de straturi celulare din transplanturi a fost cu 10-30% mai mare decât în biopsiile de piele. Autorii au observat apariția granulelor de keratohialină în a 5-a zi după transplantul de keratinocite multistratificate, iar a membranei bazale și a hemidesmozomilor - deja în a 3-a zi.

J.Rives și colab. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM și colab. (1998) au descoperit că în stadiile incipiente după transplantul de MPC la pacienții cu defecte cutanate complete după arsuri, legătura dintre derm și epidermă este foarte slabă și este o linie dreaptă, stratul papilar lipsește. Până la sfârșitul celei de-a doua luni, încep să se formeze papilele superficiale și anexele pielii, legătura dintre derm și epidermă devine mai puternică. Datele din literatură indică faptul că transplantul de keratinocite alogene pe răni la pacienții cu arsuri este o metodă promițătoare. În ciuda faptului că respingerea keratinocitelor alogene are loc, conform diferiților autori, în decurs de 10 zile până la 3 luni, acestea își joacă totuși rolul în vindecarea suprafeței plăgii, secretarea factorilor de creștere și închiderea mecanică a defectului. Se crede că MPALC au o activitate antigenică redusă, deoarece în timpul cultivării in vitro pierd celulele Langerhans, ceea ce le permite să existe în corpul receptorului pentru o perioadă lungă de timp. În plus, o cultură alogenă obținută de pe pielea unor tineri sănătoși are un potențial biologic incomparabil mai mare decât o cultură autologă de la pacienți după o leziune.

Scopul principal al studiului nostru a fost de a afla dacă keratinocitele alogene se vor înrădăcina pe cicatrici și ce modificări vor apărea în țesutul cicatricial sub influența unui astfel de „acoperire a rănii” biologic activ. În cazul unui rezultat pozitiv, să dezvoltăm cea mai eficientă și mai puțin laborioasă tehnologie pentru acest domeniu al medicinei de reabilitare.

Datele obținute de noi au fost în multe privințe similare cu datele din literatura de specialitate privind modificările morfologice care apar în epiderma umană după transplantul de keratinocite alogene în plăgi de arsură. Există însă și diferențe semnificative, atât în ceea ce privește substratul morfologic pe care are loc transplantul, cât și în ceea ce privește tehnologia. Astfel, procesul de formare a membranei bazale și a conexiunilor dermo-epidermice (hemidesmozomi, papile) are loc într-o etapă ulterioară în comparație cu transplantul de keratinocite pe suprafețele plăgilor fără modificări cicatriciale. Aparent, acest lucru se datorează nutriției mai slabe a țesutului cicatricial în comparație cu dermul sau fascia musculară. O cicatrice, în special una veche, este un țesut conjunctiv dens cu un număr foarte mic de vase, în timp ce fundul unei plăgi de arsură este țesut de granulație bogat în vase. Astfel, este evident că condițiile în care are loc transplantul și grefarea keratinocitelor sunt absolut diferite. Cu cât zona de transplant celular este mai vascularizată, cu atât procesul de grefare a acestora este mai ușor. Din acest postulat rezultă concluzia despre preferința de a lucra cu cicatrici tinere, în care țesutul conjunctiv este încă destul de lax și bogat în vase.

În urma acestei lucrări experimentale s-a demonstrat că:

1. Transplantul de MPALK pe cicatrici este posibil.
2. Metoda optimă de transplant este transplantul de keratinocite pe acoperirea plăgii.
3. Suprafața cicatricii trebuie lustruită folosind dermabraziune chirurgicală cu laser sau un cutter Schumann.
4. Sub influența MPALK, are loc o epitelizare rapidă a suprafeței lustruite a cicatricei.
5. Cu cât țesutul cicatricial este mai bine vascularizat, adică cu cât cicatricea este mai tânără, cu atât rezultatele transplantului de keratinocite sunt mai bune.
6. Sub influența keratinocitelor transplantate, țesutul cicatricial se transformă treptat și se transformă într-un țesut cicatricial dermal (mai lax, cu anexe cutanate).
7. Relaxarea treptată a țesutului cicatricial, începând cu stratul subepidermal. Vascularizația acestuia se îmbunătățește, fasciculele de fibre de colagen din părțile superioare și inferioare ale cicatricei adoptă o dispunere mai laxă decât în țesutul cicatricial fără transplant de celule. Apar foliculii de păr și glandele sebacee. Epiderma, în structura sa, după ce a trecut prin faza de hipertrofie, se apropie de epiderma pielii normale.
8. Modificările observate sunt asociate cu factorii de creștere și citokinele secretate de keratinocite, care, prin îmbunătățirea trofismului țesutului cicatricial, promovează transformarea acestuia din țesut fibros grosier în țesut mai lax, ceea ce duce la o îmbunătățire a aspectului cicatricei.

Astfel, pe baza acestui studiu, se poate concluziona că keratinocitele transplantate au un efect benefic asupra țesutului cicatricial, ceea ce poate avea implicații practice pentru reabilitarea pacienților cu diverse tipuri de cicatrici.

Această lucrare pe șobolani ne-a permis, de asemenea, să formulăm cerințele pentru acoperirile rănilor pe care sunt cultivate keratinocitele.

Pansamentele pentru răni ar trebui să fie:

• biocompatibil cu celulele,
• respirabil,
• au o bază elastică, care modelează forma,
• să fie hidrofil,
• deoarece aditivii medicinali conțin medicamente antibacteriene și antioxidanți care nu sunt toxici pentru celulele cultivate.

Rezultate clinice ale tratamentului biotehnologic al cicatricilor.

Anterior, N. Carver și colab. (1993) au descoperit că pansamentele ocluzive promovează cel mai bine atașarea la rană și supraviețuirea keratinocitelor, dar nu permit formarea epidermei stratificate (mature). Un mediu aerian este necesar pentru formarea epidermei stratificate. Prin urmare, după atașarea unui strat multistrat, s-a propus îndepărtarea pansamentului ocluziv după 7-10 zile și tratarea rănilor sub pansamente uscate sau unguente solubile în apă. Se poate spune că calitatea și proprietățile „substratului” pe care sunt cultivate celulele sunt un punct foarte important pentru eficacitatea transplantului de material celular și, prin urmare, pentru rezultatele muncii medicilor. Dar nu există un pansament ideal pentru răni astăzi, în ciuda abundenței opțiunilor propuse (piele artificială, material nețesut din carboximetilceluloză, acoperiri cu fibrină, pelicule poliuretanice semipermeabile). Un punct important în această chestiune este costul „substraturilor” (acoperiri speciale pentru răni), deoarece costul lor ridicat crește costul total al tratamentului biotehnologic.

Eficacitatea tehnologiilor celulare a fost dovedită până în prezent, dar, din păcate, aceste tehnologii sunt foarte scumpe, în special în țările în care producția industrială de compoziții celulare nu a fost stabilită. Cu toate acestea, țări precum Statele Unite au de mult timp stabilit o industrie pentru producerea de material celular pentru transplantul de arsuri. În special, compania BioSurface Technology Inc., din 1989, a cultivat 37.000 de straturi de keratinocite multistrat, care au fost utilizate pentru a trata 240 de pacienți în 79 de țări din întreaga lume (R. Odessey, 1992), în timp ce 1 cm² de cultură ^celulară costă aproximativ 7-8 dolari americani.

Tehnologia de tratare a diferitelor boli și probleme ale pielii prezintă o serie de diferențe, dar orice tratament celular se bazează pe obținerea de material celular de înaltă calitate și transplantul acestuia.

Acest proces constă în următorii pași:

• prelevarea de piele de la victime (sau de la donatori),
• transportul lamboanelor de piele la un centru de biotehnologie,
• izolarea celulelor stratului bazal și proliferarea acestora,
• creșterea straturilor multistrat de keratinocite (MLK).
• transplant de cultură celulară.

Principala problemă în efectuarea tratamentului prin transplant de foi de keratinocite multistratificate este necesitatea unor celule viabile în toate etapele transplantului celular. Bucățile de piele pentru izolarea celulelor autologe sau alogene ar trebui să fie cât mai subțiri posibil, deoarece în acest caz sunt mai ușor de separat folosind metode mecanice și enzimatice și se obține o suspensie de celule vii pentru cultivare. Acestea pot fi obținute prin tăiere cu un dermatom sau folosind pielea pleoapelor, prepuțului și suprafeței interioare a umărului. Având în vedere că celulele sunt sensibile la halogeni (clor, iod), peroxid de hidrogen, acestea nu pot fi utilizate la prelucrarea pielii în timpul colectării materialului.

Randamentul cantitativ și calitativ al celulelor din grefele de piele și eficiența cultivării acestora depind, de asemenea, de starea de sănătate și vârsta donatorului. În plus, biopsiile de piele trebuie livrate cât mai repede posibil și în condiții adecvate (mediu, temperatură) unui laborator certificat și acreditat în aceste scopuri.

Pentru depozitarea și transportul lambelor de piele, se pot utiliza mediul Eagle sau mediul 199 cu adaos de 10% ser bovin, mediul DMEM cu adaos de 5% ser fetal bovin și antibiotice.

În laboratorul de citologie, biopsia cutanată este mai întâi împărțită mecanic în bucăți mici, apoi bucățile de piele sunt procesate folosind enzime: tripsină, colagenază, dispază etc.

Sub acțiunea enzimelor, desmozomii sunt distruși, iar keratinocitele sunt eliberate în mediu sub formă de celule individuale sau agregate constând din numere diferite de celule. Pentru cultivare se utilizează doar keratinocitele bazale, care sunt cultivate pe medii speciale în termostate care conțin 5% CO2, în vase Petri sau în baloane la t = 37 °C. Deja după 48 de ore, se observă formarea de colonii de keratinocite, care se îmbină treptat pentru a se transforma într-un monostrat. După primirea unui număr suficient de celule, suspensia rezultată este însămânțată pe pansamente pentru răni pregătite în acest scop și plasată în vase Petri. Mai întâi, din suspensie se formează un monostrat și apoi un strat multistrat de keratinocite. Etapele procesului de cultivare a keratinocitelor sunt prezentate schematic în Fig. 12 (33,43,54,65).

Formarea unui strat multistrat de keratinocite potrivit pentru transplant durează de obicei 7-10 zile. Uneori, această perioadă este mai lungă, ceea ce depinde de calitatea materialului sursă (vârsta, starea de sănătate a donatorului, corectitudinea colectării materialului, calitatea mediilor utilizate etc.). Dacă stratul multistrat crește excesiv, atunci la suprafața sa pot apărea celule cu fenomene de apoptoză, nepotrivite pentru transplant. Plăcile Petri cu straturi multistrat de keratinocite (MLK) crescute în ele pe acoperiri de răni sunt livrate la clinică în recipiente speciale la o temperatură de cel puțin +15° C.

Metoda Green modificată pentru creșterea MPC

În lucrarea noastră, am folosit cambric multistrat ca acoperire pentru răni, abandonând peliculele „Polypor” cu care am început să lucrăm în experimentul cu șobolani. Astfel, am crescut straturi multistrat de keratinocite pe cambric pre-degresat și steril, deși nici acesta nu este o acoperire optimă pentru răni.

Studiile clinice au fost efectuate pe voluntari cu respectarea standardelor etice necesare: semnarea unui acord și consimțământ informat.

1. S-a utilizat o cultură a keratinocitelor proprii (autologe) și a celor stocate (alogene).
2. Keratinocitele pacienților au fost obținute dintr-o bucată de piele tăiată din interiorul părții superioare a brațelor.
3. Operația de dermabraziune a cicatricilor a fost efectuată utilizând termocauterizare, discuri rotative și un laser cu erbium.
4. Au fost luate în considerare grupuri de pacienți cu cicatrici normotrofice, hipotrofice și hipertrofice.

Procesul tehnologic de aplicare a tehnologiei celulare pentru îmbunătățirea aspectului cicatricilor cutanate a constat în următoarele etape:

1. Selecția pacienților.
2. Explicații privind esența tratamentului, intervalul de timp pentru obținerea rezultatelor așteptate, semnarea contractului și consimțământul informat.
3. Prescrieți pacienților cu 2-3 săptămâni înainte de operație selmevit 1 comprimat de 3 ori pe zi, zincteral 1 comprimat de 3 ori pe zi.
4. Luând o bucată de piele de 2,0 cm lungime și 0,7-1,0 cm lățime de pe suprafața interioară a umărului, sus, aproape în partea inferioară a regiunii axilare, pentru a obține keratinocite autologe.
5. În cazurile în care pacienții au refuzat să își izoleze propriile keratinocite din cauza posibilității unei cicatrici liniare pe suprafața interioară a umărului, s-a prelevat material celular dintr-o bancă de celule (keratinocite alogene).
6. Keratinocitele au fost izolate și cultivate într-un laborator certificat pentru acest tip de lucrare.
7. După obținerea unei cantități suficiente de MPC pentru transplantul pe cicatrici, a fost stabilită o zi pentru operație la clinică, unde materialul a fost adus în recipiente speciale în vase Petri.
8. S-a efectuat o operație de dermabraziune a cicatricilor, hemostază, suprafața lustruită a fost spălată cu o soluție salină sterilă, uscată, după care celulele celulare protetice (CPM) au fost transplantate pe aceasta pe celule cambrice sterile „în jos”. Adică, celulele care erau superioare în CPM s-au dovedit a fi inferioare, adiacente suprafeței lustruite.
9. Deasupra s-a aplicat o peliculă sterilă, care a fost fixată pe piele cu un bandaj elastic sau un plasture elastic Omnifix. În loc de peliculă, se pot folosi pansamente diferite care conțin silicon, de exemplu Mepitel, Mepiform, foi de gel de silicon.

După 5-7 zile, pelicula sau stratul de silicon este îndepărtat. Până în acest moment, toate keratinocitele ar trebui să se fi târât pe cicatricea lustruită și să se fi atașat de suprafața acesteia.

10. Mediul umed creat sub pelicula și stratul de silicon contribuie activ la acest lucru. Batista rămasă pe cicatrice din acest moment poate fi îmbibată cu gel de curiosină sau chitosan. Drept urmare, în a doua zi se creează o crustă densă, care, pentru confortul pacientului, se fixează cel mai bine cu un plasture elastic, respirabil, cum ar fi Omnifix. Crusta respirabilă permite epidermei formate să se diferențieze și să se transforme într-una matură.

În funcție de tipul cicatricii și de adâncimea frecării, bandajul este respins după 8-10 zile. În acest moment, epiderma are cu 30-40% mai multe straturi celulare decât în pielea normală. Membrana bazală nu este formată. Keratinocitele epidermei îngroșate secretă o mulțime de molecule biologic active în țesutul cicatricial.

Succesul tratamentului biotehnologic al cicatricilor depinde în mare măsură de metoda de îngrijire din perioada postoperatorie. Culturile celulare sunt un tip „blând” de acoperire a rănilor și, în stadiile incipiente după transplant, celulele intervertebrale (IPC) pot fi ușor decojite de țesuturile subiacente. Prin urmare, pacienților li se recomandă să manipuleze cicatricea cu atenție după operație. Timp de 8-9 luni, nu frecați și tratați ușor cu apă rece fiartă pentru a evita ruperea epidermei subțiri, nou create, care nu are o legătură strânsă cu țesuturile subiacente.

Nota.

Înainte de intervenția chirurgicală și în timpul dermabraziunii, utilizarea antisepticelor și oxidanților halogenați (iodopironă, suliodopironă, iodinol, iodat, clorhexidină, peroxid de hidrogen) este permisă, înainte de transplantul de celule - este strict contraindicată din cauza efectului lor citotoxic. Albastrul de metilen și verdele strălucitor sunt, de asemenea, toxice pentru celule.

Pentru a evita infecția, în special atunci când se lucrează cu cicatrici hipertrofice, câmpul chirurgical poate fi tratat cu sulfat de neomicină, polimixină sau gentamicină. Acestea nu au efect citotoxic asupra keratinocitelor.

Ca urmare a unui astfel de tratament, se obține un efect triplu.

1. Nivelarea suprafeței cicatricei.
2. Crearea unui strat de epidermă nouă de grosime normală deasupra acesteia.
3. Transformarea țesutului cicatricial în țesut dermal datorită acțiunii citokinelor, factorilor de creștere și altor molecule biologic active secretate de celulele transplantate și stimulate de acestea de keratinocite, fibroblaste și macrofage.

Cicatricea devine mai puțin vizibilă, mai elastică, apar pori și păr vellus în ea, iar pigmentarea poate fi restabilită datorită prezenței melanocitelor în IPC.

Totuși, toate aceste aspecte pozitive ale cicatricii nu apar imediat. În acest sens, este necesar să fie avertizați pacienții că procesul de transformare a țesutului cicatricial în țesut dermic are loc lent, iar rezultatul optim al unui astfel de tratament poate fi așteptat nu mai devreme de 10-14 luni. Imediat după respingerea pansamentelor, suprafețele lustruite prezintă o policromie pronunțată, cu atât mai strălucitoare, cu cât lustruirea a fost efectuată mai profund. Cele mai mici daune aduse pielii se observă la lustruirea cicatricilor normotrofice cu laser erbium. Culoarea cicatricilor și a pielii din jur a fost restabilită în decurs de 3 până la 8 săptămâni. În ciuda acestor precauții, uneori apare hiperpigmentare postoperatorie, care poate dispărea de la sine în câteva luni.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]