Rolul depozitelor de cristale în patogeneza osteoartritei

Cristalele de fosfat de calciu bazic (BCP) se găsesc în lichidul sinovial la 30-60% dintre pacienții cu osteoartrită. Conform lui A. Swan și colab. (1994), cristalele care conțin calciu se găsesc în lichidul sinovial la un număr mult mai mare de pacienți cu osteoartrită; cu toate acestea, din cauza dimensiunii extrem de mici a cristalelor sau a numărului lor mic, acestea nu sunt identificate folosind tehnici convenționale. Prezența cristalelor BCP în lichidul sinovial se corelează cu semnele radiografice ale degenerării cartilajului articular și este asociată cu un volum mai mare de revărsat comparativ cu revărsatul în articulațiile genunchiului fără cristale. Un studiu al factorilor care influențează progresia radiografică a gonartrozei a arătat că depunerea de cristale de pirofosfat de calciu dihidrat (CPPD) este un predictor al unui rezultat clinic și radiografic nefavorabil. Într-un studiu efectuat pe pacienți vârstnici, s-a constatat că osteoartrita este asociată cu condrocalcinoza, în special în compartimentul tibiofemural lateral al genunchiului și în primele trei articulații metacarpofalangiene. Nu este neobișnuit ca ambele tipuri de cristale, OFC și PFC, să fie găsite la pacienții cu osteoartrită.

Clinic, degenerarea cartilajului articular cauzată de depunerea de cristale de calciu diferă de cea observată în osteoartroza primară. Dacă cristalele ar fi un simplu epifenomen al degenerării cartilajului, acestea s-ar găsi în articulațiile cel mai des afectate de osteoartroza primară, adică genunchii, șoldurile și articulațiile mici ale mâinilor. În schimb, bolile cu depunere de cristale afectează cel mai adesea articulațiile care nu sunt tipice pentru osteoartroza primară, cum ar fi umărul, încheietura mâinii și cotul. Prezența cristalelor în lichidul articular (efuziune) este asociată cu o degenerare mai severă a cartilajului articular. Se dezbate întrebarea care este cauza și care este efectul, depunerea de cristale sau degenerarea cartilajului. O poziție intermediară este ocupată de următoarea presupunere: o anomalie primară în metabolismul cartilajului duce la degenerarea acestuia, iar depunerea secundară de cristale accelerează degradarea acestuia (așa-numita teorie a buclei de amplificare).

Mecanismul exact prin care cristalele de calciu deteriorează cartilajul articular este necunoscut și este rezumat mai jos. Teoretic, cristalele de calciu pot afecta direct condrocitele. Cu toate acestea, examinarea histologică rareori relevă cristale în apropierea condrocitelor și chiar mai rar sunt ingerate de acestea. Cel mai probabil mecanism este fagocitoza cristalelor de către celulele sinoviale, urmată de eliberarea de enzime proteolitice sau secreția de citokine care stimulează eliberarea de enzime de către condrocite. Acest concept este susținut de un studiu privind rolul sinovitei induse de PFKD în dezvoltarea osteoartritei rapid progresive în artropatia cu pirofosfat. În acest studiu, cristale de pirofosfat de calciu dihidrat (1 sau 10 mg) au fost injectate săptămânal în genunchiul drept al iepurilor cu osteoartrite indusă prin meniscectomie laterală parțială. S-a constatat că, după 8 injecții, articulația genunchiului drept a prezentat modificări semnificativ mai grave în comparație cu cea stângă. Intensitatea inflamației sinoviale a fost corelată cu injecțiile intra-articulare de cristale de pirofosfat de calciu dihidrat și doza acestora. În ciuda faptului că dozele de cristale CPPD utilizate în acest studiu le depășesc pe cele in vivo, rezultatele indică rolul inflamației induse de CPPD în progresia osteoartritei în artropatia pirofosfatică.

Mecanismele potențiale de inducere a deteriorării cartilajului articular de către cristalele care conțin calciu sunt asociate cu proprietățile lor mitogene, capacitatea de a induce MMP-uri și de a stimula sinteza prostaglandinelor.

Efectul mitogen al cristalelor care conțin calciu. În artropatiile asociate cristalelor, se observă frecvent proliferarea celulelor de căptușeală sinovială, cristalele în sine fiind doar parțial responsabile pentru acest proces. Creșterea numărului de celule sinoviale este însoțită de o secreție crescută de citokine, care promovează condroliza și induc secreția de enzime proteolitice. Cristalele OFC, la concentrații întâlnite în patologia articulară umană, stimulează dependent de doză mitogeneza culturilor de fibroblaste cutanate în repaus și a fibroblastelor sinoviale canine și șoarece. Cristalele de pirofosfat de calciu dihidrat, urat, sulfat, carbonat și fosfat de calciu stimulează creșterea celulară. Debutul și vârful încorporării ( ^3H )-timidinei induse de aceste cristale sunt decalate cu 3 ore față de stimularea celulelor cu ser sanguin. Această perioadă de timp poate fi necesară pentru fagocitoză și dizolvarea cristalelor. Adăugarea de cristale de control de aceeași dimensiune (de exemplu, praf de diamant sau particule de latex) nu a stimulat mitogeneza. Cristalele de urat de sodiu monohidrat au avut proprietăți mitogenice slabe și au fost semnificativ inferioare celor ale uratului de calciu, indicând importanța conținutului de calciu al cristalelor în mitogeneză. Cristalele OFC sintetice au avut aceleași proprietăți mitogenice ca și cristalele obținute de la pacienții cu condrocalcinoză. Efectul mitogenic al cristalelor care conțin calciu nu a fost rezultatul unei creșteri a conținutului de calciu al mediului nutritiv înconjurător in vitro, deoarece dizolvarea cristalelor de fosfat de calciu bazic în mediul nutritiv nu a stimulat încorporarea ( ^3H )-timidinei de către fibroblaste.

Un mecanism propus pentru mitogeneza indusă de OFC este acela că proliferarea anormală a celulelor sinoviale se poate datora, cel puțin parțial, endocitozei și dizolvării intracelulare a cristalelor, ceea ce crește concentrațiile citoplasmatice de Ca2 ⁺ și activează calea dependentă de calciu care duce la mitogeneză. Acest concept este susținut de necesitatea contactului direct celulă-cristal pentru a stimula mitogeneza, deoarece expunerea culturilor celulare la cristale a indus creșterea celulară, în timp ce expunerea celulelor lipsite de un astfel de contact nu a făcut-o. Pentru a studia necesitatea fagocitozei cristalelor în urma interacțiunii celulă-cristal, celulele au fost cultivate cu ^45Ca -OPC și ( ^3H )-timidină. S-a constatat că celulele care conțin ^45Ca -OPC au încorporat semnificativ mai multă ( ^3H )-timidină decât celulele fără marcare bazică cu fosfat de calciu. În culturile de macrofage, inhibarea endocitozei cristalelor de către citocalazină a dus la inhibarea dizolvării cristalelor, subliniind în continuare necesitatea fagocitozei.

Cristalele care conțin calciu sunt solubile în acid. După fagocitoză, cristalele se dizolvă în mediul acid al fagolizozomilor macrofagi. Clorochina, clorura de amoniu, bafilomicina A1 și toți agenții lizomotropi care cresc pH-ul lizozomal inhibă dependent de doză dizolvarea intracelulară a cristalelor și absorbția (3H)-timidinei ^în fibroblastele cultivate cu cristale bazice de fosfat de calciu.

Adăugarea cristalelor de fosfat de calciu (OFC) la o cultură de fibroblaste în monostrat a cauzat o creștere imediată de zece ori a calciului intracelular, care a revenit la valorile inițiale după 8 minute. Sursa de calciu a fost predominant ionii extracelulari, deoarece cristalele bazice de fosfat de calciu au fost adăugate la un mediu de cultură fără calciu. Următoarea creștere a concentrației intracelulare de calciu a fost observată după 60 de minute și a durat cel puțin 3 ore. Aici, sursa de calciu au fost cristalele fagocitozate dizolvate în fagolizozomi.

S-a constatat că efectul mitogen al cristalelor OFC este similar cu cel al PDGF ca factor de creștere; la fel ca acesta din urmă, cristalele OFC prezintă sinergism cu IGF-1 și plasma sanguină. Blocarea IGF-1 reduce mitogeneza celulară ca răspuns la OFC. P.G. Mitchell și colab. (1989) au arătat că inducerea mitogenezei în fibroblastele Balb/c- _{3 T3de către} cristalele OFC necesită prezența serin/treonin protein kinazei C (PKC), unul dintre principalii mediatori ai semnalelor generate în timpul stimulării externe a celulelor cu hormoni, neurotransmițători și factori de creștere. O scădere a activității PKC în celulele Balb/c-3 T3 _{inhibă inducerea mediată deOFC} a proto-oncogenelor c-fos și c-myc, dar nu afectează stimularea acestor oncogene mediată de PDGF.

Creșterea calciului intracelular în urma dizolvării cristalelor fagocitate nu este singura cale de semnalizare pentru mitogeneză. Atunci când factorii de creștere, cum ar fi PDGF, se leagă de receptorul lor membranar, este stimulată fosfolipaza C (o fosfodiesterază), care hidrolizează fosfatidilinozitolul 4,5-bisfosfat pentru a forma mesagerii intracelulari inozitol-3-fosfat și diacilglicerol. Primul eliberează calciu din reticulul endoplasmatic prin modularea activității enzimelor dependente de calciu și calciu/calmodulină, cum ar fi protein kinazele și proteazele.

R. Rothenberg și H. Cheung (1988) au raportat o degradare crescută a fosfatidilinozitolului 4,5-bisfosfat de către fosfolipaza C în celulele sinoviale de iepure, ca răspuns la stimularea cu cristale OFC. Aceasta din urmă a crescut semnificativ conținutul de inozitol-1-fosfat în celulele cu ( ^3H )-inozitol marcat; vârful a fost atins în decurs de 1 minut și a persistat timp de aproximativ 1 oră.

Diacilglicerolul este un potențial activator al pirofosfatului de calciu dihidrat. Deoarece cristalele OFC cresc activitatea fosfolipaza C, ceea ce duce la acumularea de diacilglicerol, în consecință, ne putem aștepta la o creștere a activării PKC. P.G. Mitchell și colab. (1989) au comparat efectele cristalelor OFC și PDGF asupra sintezei ADN-ului de către _{fibroblastele Balb/c-3T3}. În cultura celulară, PKC a fost inactivată prin incubarea celulelor cu diesterul forbolului care susține tumora (TPD), un analog al diacilglicerolului. Stimularea pe termen lung cu doze mici de TPD a scăzut activitatea PKC, în timp ce o singură stimulare cu o doză mare a activat-o. Stimularea sintezei ADN-ului de către cristalele OFC a fost suprimată după inactivarea PKC, indicând importanța acestei enzime în mitogeneza indusă de OFC. Anterior, GM McCarthy și colab. (1987) au demonstrat o legătură între răspunsul mitogenic al fibroblastelor umane la cristalele OFC și activarea PKC. Cu toate acestea, cristalele OFC nu activează fosfatidilinozitol 3-kinaza sau tirozin kinazele, confirmând că mecanismul de activare celulară de către cristalele OFC este selectiv.

Proliferarea celulară este controlată de un grup de gene numite proto-oncogene. Proteinele foe și mye, produse ale proto-oncogenelor c-fos și c-myc, sunt localizate în nucleul celular și legate de secvențe specifice de ADN. Stimularea fibroblastelor 3T3 cu cristale OFC are ca rezultat exprimarea c-fos în câteva minute, care atinge un maxim la 30 de minute după stimulare. Inducerea transcripției c-myc de către cristale OFC sau PDGF are loc în decurs de 1 oră și atinge un maxim la 3 ore după stimulare. Celulele mențin un nivel ridicat de transcripție c-fos și c-myc timp de cel puțin 5 ore. În celulele cu PCD inactivat, stimularea c-fos și c-myc de către cristale OFC sau TFD este semnificativ suprimată, în timp ce inducerea acestor gene de către PDGF nu se modifică.

Membrii familiei protein kinazei activate de mitogeni (MAP K) sunt regulatori cheie ai diferitelor cascade de semnalizare intracelulară. O subclasă a acestei familii, p42/p44, reglează proliferarea celulară printr-un mecanism care implică activarea proto-oncogenelor c-fos și c-jun. Cristalele OFC și PFKD activează o cale de semnalizare a protein kinazei care implică atât p42, cât și p44, sugerând un rol al acestei căi în mitogeneza indusă de cristale care conțin calciu.

În cele din urmă, mitogeneza indusă de OFC implică factorul de transcripție nuclear κB (NF-κB), care a fost descris inițial ca gena lanțului ușor al imunoglobulinei κ (IgK). Este un factor de transcripție inductibil important în multe căi de semnalizare, deoarece reglează expresia diferitelor gene. Inducerea NF-κB este de obicei cuplată cu eliberarea proteinelor inhibitoare numite IκB din citoplasmă. Inducerea NF-κB este urmată de translocarea factorului de transcripție activ în nucleu. Cristalele OFC induc NF-κB în fibroblastele Balb/c- _3T3 și fibroblastele pielii umane.

Mai multe căi pot fi implicate în transducția semnalului după activarea NF-κB, dar toate implică protein kinaze care fosforilează (și astfel degradează) IκB. Pe baza studiilor in vitro, anterior se credea că IκB servește drept substrat pentru kinaze (de exemplu, PKC și protein kinaza A). Cu toate acestea, recent a fost identificat un complex kinazic IκB cu greutate moleculară mare. Aceste kinaze fosforilează în mod specific reziduurile de serină ale IκB. Activarea NF-κB de către TNF-α și IL-1 necesită acțiunea eficientă a kinazei inductoare de NF-κB (NIK) și a kinazei IκB. Mecanismul molecular al activării NIK este în prezent necunoscut. Deși cristalele OFC activează atât PKC, cât și NF-κB, măsura în care aceste două procese pot fi legate este necunoscută. Deoarece modificarea kinazei GκB are loc prin fosforilare, nu se poate exclude un rol al PKC în inducerea NF-κB de către cristalele OFC prin fosforilare și activarea kinazei GκB. Acest concept este susținut de inhibarea mitogenezei induse de cristalele OFC și a expresiei NF-κB de către inhibitorul PKC, staurosporina. În mod similar, staurosporina poate inhiba kinaza GκB și, prin urmare, inhibă proteina kinaza A și alte protein kinaze.

Astfel, mecanismul mitogenezei induse de cristalele OFC în fibroblaste include cel puțin două procese diferite:

• un eveniment rapid de legare la membrană care are ca rezultat activarea PKC și MAP K, inducerea NF-κB și a proto-oncogenelor,
• dizolvarea intracelulară mai lentă a cristalelor, ceea ce duce la o creștere a conținutului intracelular de Ca2 ⁺ și apoi la activarea unui număr de procese dependente de calciu care stimulează mitogeneza.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Inducerea prin cristale care conțin MMP-calciu

Mediatorii deteriorării țesuturilor de către cristalele care conțin calciu sunt MMP-urile - colagenază-1, stromelizină, gelatinază de 92 kD și colagenază-3.

Având în vedere relația dintre conținutul de cristale de OFC și distrugerea țesutului articular, a fost emisă ipoteza conform căreia cristalele de OFC și, posibil, unii colageni sunt fagocitozați de celulele sinoviale. Sinovocitele stimulate proliferează și secretă proteaze. Această ipoteză a fost testată in vitro prin adăugarea de OFC, PFCD și alte cristale naturale sau sintetice la sinovocite cultivate umane sau canine. Activitatea proteazelor și colagenazelor neutre a crescut dependent de doză și a fost de aproximativ 5-8 ori mai mare decât cea a culturii celulare de control crescute fără cristale.

În celulele cultivate într-un mediu care conține cristale, a fost detectată co-inducerea ARNm al colagenazei-1, stromelizinei și gelatinazei-92 kDa, urmată de secreția de enzime în mediu.

Cristalele OFC au indus, de asemenea, acumularea de ARNm de colagenază-1 și colagenază-2 în condrocitele porcine mature, urmată de secreția enzimelor în mediu.

GM McCarty și colab. (1998) au studiat rolul dizolvării intracelulare a cristalelor în producția de MMP indusă de cristale. Creșterea pH-ului lizozomal cu bafilomicină A a inhibat dizolvarea intracelulară a cristalelor și a atenuat, de asemenea, răspunsul proliferativ al fibroblastelor umane la cristalele de OFC, dar nu a inhibat sinteza și secreția de MMP.

Nici fosfatul bazic de calciu, nici cristalele de PFCD nu au indus producția de IL-1 in vitro, dar cristalele de urat de sodiu au făcut-o.

Datele actuale indică în mod clar stimularea directă a producției de MMP de către fibroblaste și condrocite la contactul cu cristale care conțin calciu.

Simptomele osteoartritei indică un rol semnificativ al MMP în progresia bolii. Prezența cristalelor care conțin calciu crește degenerarea țesuturilor articulațiilor afectate.

Stimularea sintezei prostaglandinelor

Împreună cu stimularea creșterii celulare și a secreției de enzime, cristalele care conțin calciu determină eliberarea de prostaglandine din culturile de celule de mamifere, în special PGE2 _. Eliberarea de PGE2 are loc _în toate cazurile în prima oră după expunerea celulelor la cristale. R. Rothenberg (1987) a stabilit că principalele surse de acid arahidonic pentru sinteza PGE2 _sunt fosfatidilcolina și fosfatidiletanolamina și a confirmat, de asemenea, că fosfolipaza A2 _și NOX sunt căile dominante pentru _producerea de PGE2.

PGE1 poate fi eliberat și ca răspuns la cristalele de OFA. GM McCarty și colab. (1993, 1994) au studiat efectele PGE2 _, PGE și analogului său misoprostol asupra răspunsului mitogen al fibroblastelor umane la cristalele de OFA. Toți cei trei agenți au inhibat răspunsul mitogen într-un mod dependent de doză, PGE și misoprostolul prezentând o activitate inhibitorie mai pronunțată. PGE2 și misoprostolul, dar nu PGE2 _, au inhibat acumularea de ARNm de colagenază ca răspuns la cristalele de OFA.

MG McCarty și H. Cheung (1994) au investigat mecanismul activării celulelor mediate de OFC prin PGE. Autorii au arătat că PGE, un inductor mai puternic al cAMP intracelular decât PGE2 _și PGE, inhibă mitogeneza indusă de OFC și producția de MMP printr-o cale de transducție a semnalului dependentă de cAMP. Este posibil ca creșterea producției de PGE indusă de cristalele OFC să slăbească celelalte efecte biologice ale acestora (mitogeneza și producția de MMP) printr-un mecanism de feedback.

Inflamația indusă de cristale

Cristalele care conțin calciu se găsesc adesea în lichidul sinovial al pacienților cu osteoartroză, însă episoadele de inflamație acută cu leucocitoză sunt rare atât în osteoartroză, cât și în artropatiile asociate cu cristale (de exemplu, sindromul umărului Milwaukee). Potențialul flogistic al cristalelor poate fi modificat de o serie de factori inhibitori. R. Terkeltaub și colab. (1988) au demonstrat capacitatea serului și plasmei sanguine de a inhiba semnificativ răspunsul granulocitelor neutrofile la cristalele bazice de fosfat de calciu. Factorii care provoacă o astfel de inhibare sunt proteinele care leagă cristalele. Un studiu al uneia dintre aceste proteine, o glicoproteină ₂ -HS (AHSr), a arătat că AHSR este cel mai puternic și specific inhibitor al răspunsului granulocitelor neutrofile la cristalele de fosfat sinovial (OFC). AHSr este o proteină serică de origine hepatică; se știe că, în comparație cu alte proteine serice, se găsește în concentrații relativ mari în țesutul osos și mineralizant. În plus, AHSr este prezent în lichidul sinovial „neinflamat” și a fost detectat și pe cristalele de fosfat de calciu bazic din lichidul sinovial nativ. Prin urmare, nu poate fi exclusă posibilitatea ca AHSr să moduleze potențialul flogogenic al cristalelor de fosfat de calciu bazic in vivo.

Pentru a rezuma toate cele de mai sus, prezentăm două scheme de patogeneză a osteoartritei propuse de WB van den Berg et al. (1999) şi M. Carrabba şi colab. (1996), care combină factori mecanici, genetici și biochimici.