Modele experimentale de osteoartrită

Cartilajul este un țesut extrem de specializat, care conține un singur tip de celule (condrocite) și se caracterizează prin absența vaselor de sânge și limfatice. Cartilajul este hrănit în principal prin absorbția din lichidul sinovial. Metabolismul condrocitelor este reglat de o serie de factori solubili produși local de condrocite și țesuturile înconjurătoare. Funcția condrocitelor depinde, de asemenea, de compoziția mediului extracelular (tensiunea oxigenului, concentrația de ioni, pH-ul etc.), de compoziția ECM, de interacțiunea celulelor și matricei și de semnalele fizice. Obiectivul principal al modelării experimentale este de a crea culturi în mediul extracelular fără a modifica fenotipul celulelor mature. Al doilea obiectiv este de a crea culturi pentru a studia răspunsul prematur, întârziat, pe termen scurt sau prelungit al condrocitelor la semnale chimice și/sau fizice. Studiile in vitro oferă, de asemenea, o oportunitate de a studia comportamentul condrocitelor în osteoartroză. Al treilea obiectiv este de a dezvolta sisteme de cocultură care să permită studierea interacțiunilor diferitelor țesuturi din articulație. A patra sarcină este pregătirea implanturilor de cartilaj pentru transplantul ulterior. Și, în final, a cincea sarcină este studiul factorilor de creștere, citokinelor sau agenților terapeutici capabili să stimuleze repararea și/sau să inhibe resorbția cartilajului.

În ultimele decenii, au fost create diverse modele de culturi celulare ale cartilajului articular, inclusiv culturi în monostrat, culturi suspendate, culturi de condroni, explante, coculturi și culturi de celule nemuritoare. Fiecare cultură are propriile avantaje și dezavantaje și fiecare este potrivită pentru studierea unui aspect specific al metabolismului condrocitelor. Astfel, explantele de cartilaj reprezintă un model excelent pentru studierea ratei de rotație a elementelor matricei, care necesită receptori autentici de suprafață celulară și interacțiuni normale celulă-matrice și matrice-celulă. În același timp, se recomandă studierea depozitelor de matrice sau a mecanismelor care reglează metabolismul condrocitelor pe o cultură de celule izolate. O cultură în monostrat cu densitate mică este necesară pentru studierea procesului de diferențiere celulară. Culturile suspendate într-o matrice naturală sau sintetică reprezintă un model pentru analiza răspunsului adaptiv al condrocitelor la stresul mecanic.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Culturi de condrocite

La selectarea țesutului cartilaginos pentru studii in vitro trebuie luate în considerare câteva aspecte importante. Compoziția matricei și activitatea metabolică a condrocitelor variază în funcție de articulație, iar aceasta din urmă depinde și de adâncimea localizării condrocitelor în țesut. Aceste date au fost obținute în cadrul mai multor experimente în care au fost studiate subpopulații de condrocite izolate din zone cartilaginoase de diferite adâncimi. Au fost constatate o serie de diferențe morfologice și biochimice între condrocitele cultivate situate în straturile superficiale și profunde ale cartilajului articular. Celulele superficiale sintetizează o matrice fibrilară rară, săracă în proteoglicani, în timp ce celulele mai profunde produc o matrice bogată în fibrile și proteoglicani. Mai mult, celulele superficiale produc relativ mai mulți proteoglicani mici neagregați și acid hialuronic și relativ mai puțin agrecan și sulfat de keratan decât condrocitele mai profunde. O altă caracteristică distinctivă importantă a metabolismului condrocitelor izolate din zonele cartilaginoase de diferite adâncimi este răspunsul la un stimul exogen. Conform lui M. Aydelotte și colab., condrocitele bovine din zona superficială a cartilajului au fost mai sensibile la IL-1 decât celulele din zona profundă.

Comportamentul celular depinde și de localizarea țesutului. Condrocitele din cartilajul coastelor și al urechii de la același animal răspund diferit la factorii de creștere, cum ar fi factorul de creștere a fibroblastelor (FGF) și TGF-beta. FGF a crescut încorporarea de timidină, prolină și leucină în cultura coastelor, dar nu și în condrocitele auriculare. TGF-beta a crescut încorporarea de timidină în condrocitele cartilajului coastelor și al urechii, dar nu a avut niciun efect asupra încorporării de timidină și prolină în condrocitele auriculare. Celulele cartilajului din zonele cu stres ridicat diferă de cele din zonele cu stres scăzut asupra cartilajului. Astfel, condrocitele cartilajului articulației genunchiului de oaie matură din regiunea centrală a suprafeței articulare a tibiei care nu este acoperită de menisc, care suportă cea mai mare încărcătură in vivo, sintetizează mai puțin agrecan, dar mai mult decorin decât celulele din zonele acoperite de menisc. Autorii subliniază, de asemenea, importanța utilizării cartilajului din zone articulare identice atunci când se studiază funcția sintetică a articulațiilor.

Metabolismul condrocitelor și răspunsul lor la factorii de reglare depind, de asemenea, semnificativ de vârsta donatorului, de dezvoltarea scheletică a acestuia și de starea articulațiilor din care sunt prelevate celulele. În condrocitele umane se observă o scădere semnificativă a răspunsului proliferativ odată cu vârsta. Cea mai mare scădere se observă la donatorii cu vârsta cuprinsă între 40-50 de ani și peste 60 de ani. Mai mult, severitatea răspunsului proliferativ la factorii de creștere (de exemplu, FGF și TGF-beta) scade odată cu înaintarea în vârstă. Pe lângă modificările cantitative ale proliferării condrocitelor, există și modificări calitative. Celulele de la donatori tineri (10-20 de ani) răspund mai bine la factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF) decât la TGF-beta, în timp ce opusul se observă la celulele de la donatori adulți. Există mai multe mecanisme utilizate pentru a explica modificările dependente de vârstă în funcția sintetică a condrocitelor și răspunsul lor la factorii de creștere. Acestea includ o scădere a numărului și afinității receptorilor celulari de suprafață, modificări ale sintezei și bioactivității factorilor de creștere și citokinelor și modificarea semnalelor post-receptor.

Starea patologică a articulațiilor modifică, de asemenea, morfologia și activitatea metabolică a condrocitelor. Astfel, J. Kouri și colab. (1996) au identificat trei subpopulații de condrocite în cartilajul în osteoartroză. Condrocitele din partea superficială și superioară a mijlocului cartilajului formează clustere și sintetizează o cantitate mai mare de proteoglicani și colagen. TGF-beta și factorul de creștere asemănător insulinei (IGF) sunt capabile să stimuleze sinteza proteoglicanilor de către condrocite și să neutralizeze parțial efectele IL-1 și TNF-a. Explantele de cartilaj afectat de osteoartroză și condrocitele izolate din cartilajul unui pacient cu osteoartroză sunt mai sensibile la stimularea TGF-beta decât condrocitele din cartilajul sănătos. Aceste diferențe sunt cel mai probabil asociate cu modificări fenotipice ale condrocitelor din straturile superioare ale cartilajului articular.

Izolarea condrocitelor individuale se realizează prin tratarea secvențială a ECM cu enzime proteolitice. După eliberarea lor din ECM, celulele izolate sunt ideale pentru studierea sintezei de novo a componentelor matricei. Unii autori utilizează doar colagenază clostridială, în timp ce alții preincubează cartilajul cu tripsină, pronază, DNază și/sau hialuronidază. Numărul de celule izolate depinde de enzimele utilizate. Astfel, atunci când sunt tratate doar cu colagenază, se pot obține ^{1,4-10⁶ condrocite din 1 g de țesut, în timp ce utilizând pronază, hialuronidază și colagenază -4,3-10⁶}. Când sunt tratate cu colagenază, agrecanul, proteinele, IL-6 și IL-8 rămân în cultura celulară în cantități semnificativ mai mari decât în cazul tratamentului secvențial cu enzime diferite. Există mai multe explicații pentru aceste diferențe dintre cele două culturi celulare:

• Receptorii celulari sunt deteriorați sau inhibați de enzime, TGF-beta inhibă sinteza ADN-ului și a proteoglicanilor în condrocitele proaspăt izolate (ziua 1), în timp ce sinteza ADN-ului și a proteoglicanilor în condrocitele cultivate într-un monostrat (7 zile) este stimulată de TGF-beta. Cu toate acestea, este necesară o perioadă adecvată pentru reexprimarea acestor componente membranare înainte de începerea experimentului.
• Proteazele exogene pot perturba interacțiunea celulă-matrice mediată de integrină. Familia integrinelor promovează atașarea condrocitelor la moleculele ECM (Shakibaei M. et al., 1997). Această perturbare poate afecta expresia genelor matriceale.
• Resturile componentelor matriceale pot regla funcția sintetică a condrocitelor. Integrinele sunt capabile să recunoască produsele degradării ECM, jucând astfel un rol important în repararea țesuturilor după acțiunea enzimelor proteolitice. T. Larsson și colab. (1989) au raportat că adăugarea de proteoglicani intacți sau fragmentați la cultura celulară stimulează sinteza proteinelor și proteoglicanilor. Cu toate acestea, un nivel ridicat de acid hialuronic determină o scădere semnificativă a includerii sulfaților în sinteza proteoglicanilor de către condrocitele embrionului de pui, condrocitele mature ale celulelor de condrosarcom de porc și șobolan. Mai mult, acidul hialuronic este un inhibitor al eliberării proteoglicanilor din celule chiar și în prezența IL-1b, TNF-a, FGF, ceea ce indică contracararea primei activități biologice a factorilor de creștere și a citokinelor. Mecanismul exact care stă la baza acțiunii acidului hialuronic rămâne neclar; se știe că condrocitele conțin un receptor pentru acidul hialuronic asociat cu filamentele de actină ale citosolului. Legarea acidului hialuronic la receptorul său stimulează fosforilarea proteinelor. Astfel, aceste date demonstrează modularea funcției metabolice a condrocitelor de către molecule fragmentate sau native ale proteinelor matriceale prin activarea receptorilor membranei celulare.
• Stimularea rapidă a sintezei proteinelor matriceale de către condrocite prin intermediul enzimelor poate fi o consecință a modificărilor formei condrocitelor și/sau a reorganizării citoscheletului.
• Unele citokine (de exemplu, IL-8) și factori de creștere (de exemplu, IGF-1, TGF-β) sunt sechestrați în ECM. Cel mai cunoscut exemplu este legarea TGF-β de către decorină, ceea ce duce la o capacitate scăzută a primei de a induce creșterea celulară în celulele ovariene de hamster chinezesc. Constatarea că decorina din cartilaj crește odată cu vârsta sugerează o scădere a biodisponibilității TGF-β odată cu înaintarea în vârstă. Factorii de creștere și citokinele pot fi eliberați din resturile matriceale în timpul culturii și, ulterior, pot modula funcția condrocitelor.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Cultură monostrat de condrocite

Fenotipul diferențiat al condrocitelor este caracterizat în principal prin sinteza colagenului de tip II și a proteoglicanilor specifici țesutului, precum și prin un nivel scăzut de activitate mitotică. Există dovezi că, odată cu cultivarea prelungită a celulelor într-un monostrat, precum și după mai multe pasaje celulare repetate, condrocitele își pierd contururile sferice și dobândesc o formă alungită, asemănătoare fibroblastelor. Cu o astfel de metaplazie fibroblastică, funcția sintetică a celulelor este, de asemenea, modificată, caracterizată printr-o scădere progresivă a sintezei colagenului de tipuri II, IX și XI și o creștere a sintezei colagenului de tipuri I, III și Y. Proteoglicanii mici, neagregați, sunt sintetizați datorită agrecanului funcțional. Sinteza catepsinei B și L este extrem de scăzută în celulele diferențiate, dar crește în procesul de pierdere a diferențierii. Colagenaza-1 este exprimată în condrocitele diferențiate; odată cu cultivarea prelungită, expresia sa scade, în timp ce producția de inhibitori tisulari ai metaloproteazelor (TIMP) crește.

Condrocitele diferențiate reexprimă colagenul cu fenotip diferențiat atunci când sunt transferate din monostrat în cultură suspendată. Procesul de diferențiere este probabil legat de forma celulei. Această proprietate este utilizată în mod regulat de cercetătorii care studiază grefe defecte cu condrocite autologe. Un număr mic de celule obținute din material bioptic poate fi extins în cultură monostrat și apoi reintrodus într-o matrice tridimensională înainte de transplant. Reexprimarea unui fenotip specific de către condrocitele dediferențiate transferate în cultură de agaroză poate fi stimulată de TGF-β, complexul osseină-hidroxiapatită și acidul ascorbic.

Ca răspuns la factorii de creștere și citokine, condrocitele sunt modificate în timpul procesului de diferențiere. Răspunsul celular la citokine și factori de creștere diferă între condrocitele nediferențiate și cele diferențiate. IL-1 stimulează proliferarea fibroblastelor, în timp ce creșterea condrocitelor nediferențiate este inhibată de IL-1. Sinteza ADN-ului este stimulată de IGF-1 în condrocitele alungite, dar nu aplatizate. În condrocitele diferențiate, efectele stimulatoare ale IL-1 beta și TNF-α asupra producției de procolagenază sunt mai pronunțate decât în condrocitele nediferențiate.

Cultivarea condrocitelor

Cultivarea condrocitelor în suspensie într-un mediu lichid sau într-o matrice tridimensională naturală sau sintetică stabilizează fenotipul condrocitelor. Celulele își păstrează forma sferică și sintetizează proteine specifice țesutului. Cultura suspendată a condrocitelor este de obicei recomandată pentru studierea formării unei noi matrice pericelulare. Culturile de condrocite în polimeri absorbanți sintetici sau naturali sunt utilizate pentru implantarea celulelor în defectele cartilajului pentru a stimula regenerarea țesutului cartilajului articular. Mediul sintetic sau natural pentru celulele implantate trebuie să îndeplinească o serie de cerințe:

• implanturile trebuie să aibă o structură poroasă pentru aderența și creșterea celulară,
• nici polimerul în sine, nici produșii săi de degradare nu ar trebui să provoace inflamații sau reacții toxice atunci când sunt implantați in vivo,
• purtătorul de grefă trebuie să aibă capacitatea de a se lega de cartilajul adiacent sau de osul subcondral,
• matricea naturală sau sintetică trebuie să aibă capacitatea de a absorbi, degradarea acesteia trebuie echilibrată prin regenerarea țesuturilor,
• Pentru a facilita repararea cartilajului, structura chimică și arhitectura porilor matricei trebuie să faciliteze menținerea fenotipului celular și sinteza proteinelor specifice țesuturilor de către condrocitele plasate în aceasta,
• În timpul implantării in vivo, este necesar să se studieze proprietățile mecanice ale matricei sintetice sau naturale.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Suspensia condrocitelor în fază lichidă

Atașarea celulelor la vasele de plastic în care sunt cultivate condrocitele poate fi prevenită prin acoperirea pereților acestora cu o soluție de metilceluloză, agaroză, hidrogel (metacrilat de poli-2-hidroxietil) sau un amestec de colagen-agaroză. În aceste condiții, condrocitele formează clustere și sintetizează în principal agrecan și colageni specifici țesuturilor (tipurile II, IX, XI). Se găsesc de obicei două tipuri de celule. Celulele situate în centru păstrează o formă sferică și sunt înconjurate de o ECM bine dezvoltată, lucru confirmat prin studii histochimice și ultrastructurale. La periferie, condrocitele au contururi discoide și sunt înconjurate de o ECM rară; se cunosc puține lucruri despre caracteristicile funcționale ale acestor celule.

Este posibilă cultivarea condrocitelor pe micropurtători menținuți în suspensie; ca micropurtători se utilizează perle de dextran (Cytodex), perle de dextran acoperite cu colagen (Cytodex III) și microsfere neporoase de colagen de tip I (Cellagen). În aceste condiții de cultivare, condrocitele se atașează de suprafața micropurtătorului, își păstrează forma sferică și produc un material asemănător unei matrice. Mai mult, utilizarea cellagenului promovează proliferarea condrocitelor și reexprimarea fenotipului normal. Prin urmare, cultivarea condrocitelor pe microsfere de cellagen poate fi utilizată pentru a restabili fenotipul celular înainte de transplant.

O altă metodă de cultivare a suspensiei de condrocite într-un mediu lichid este cultivarea lor sub formă de bile dense constând din celule (0,5-1 * 10 ^b ), obținute prin centrifugare. Astfel de condrocite sunt capabile să producă o matrice care conține o cantitate mare de proteoglicani, colagen de tip II, dar nu și colagen de tip I, ceea ce este confirmat prin metode histologice, imunohistochimice și cantitative.

Suspensia condrocitelor în ECM naturală

Condrocitele pot fi cultivate în suspensie într-o matrice tridimensională (agar moale, agaroză, gel sau burete de colagen, acid hialuronic, adeziv de fibrină, sfere de alginat).

Condrocitele cultivate în agaroză își păstrează fenotipul normal și sintetizează colagen de tip II și agregate de agrecan specifice țesutului. Atunci când sunt cultivate în agaroză, proteoglicanii sintetizați de celulă sunt eliberați în mediu timp de 50 de zile. Pentru comparație, într-o cultură în monostrat, faza celulară este supraîncărcată cu glicozaminoglicani deja în primele 5-6 zile de cultivare; atunci când sunt cultivate în mediu, după creșterea sintezei și eliberarea glicozaminoglicanilor în primele 8-10 zile, are loc o scădere dependentă de timp a acestora. Cu toate acestea, comportamentul condrocitelor atunci când sunt cultivate în agaroză diferă de cel in vivo. În agaroză, un număr mare de agregate de agrecan sintetizate conțin molecule mai mici și mai puține molecule decât in vivo. TGF-β stimulează sinteza proteoglicanilor în explant, dar reduce sinteza agrecanilor în agaroză.

Alginatul este un polizaharid liniar obținut din alge marine brune. În prezența cationilor divalenți, cum ar fi ionii de Ca2 ⁺, acest polimer devine un gel. Fiecare condrocit prins în alginat este înconjurat de o matrice de polizaharide încărcate negativ, ai căror pori sunt comparabili cu cei din cartilajul hialin. Matricea formată de condrocite în perlele de alginat este formată din două compartimente - un strat subțire de matrice asociată celulelor, corespunzător matricei pericelulare și teritoriale a cartilajului articular, și o matrice mai îndepărtată, echivalentă cu cea interteritorială din țesutul nativ. În a 30-a zi de cultură, volumul relativ și absolut ocupat de celule și de fiecare dintre cele două compartimente dintr-o perlă de alginat sunt aproape complet identice cu cele din cartilajul nativ. Timp de aproape 30 de zile, condrocitele își păstrează forma sferică și produc agrecan, ale cărui proprietăți hidrodinamice sunt similare cu cele ale moleculelor de agrecan din matricea cartilajului articular, precum și molecule de colagen de tipurile II, IX și XI. În același timp, la fel ca în cazul altor culturi în suspensie, pe suprafața perlelor de alginat sunt prezente celule aplatizate, care produc o cantitate mică de molecule de colagen de tip I, care sunt eliberate direct în mediu și nu sunt încorporate în ECM. În perlele de alginat se observă o proliferare moderată a condrocitelor. După 8 luni de cultivare în gel de alginat, condrocitele mature nu își pierd activitatea metabolică și continuă să sintetizeze colagen de tip II specific țesutului și agrecan.

H. Tanaka și colab. (1984) au investigat proprietățile de difuzie ale diferitelor molecule naturale din alginat și au descoperit că moleculele mai mari de 70 kDa nu difuzează prin alginat. Prin urmare, cultura celulară în alginat este potrivită pentru studierea reglării biosintezei matricei și a organizării ECM. Disponibilitatea celulelor cultivate în alginat permite studierea acțiunii factorilor de reglare peptidică și a agenților farmacologici la nivel transcripțional, post-transcripțional și translațional.

Condrocitele sunt cultivate și într-o matrice de fibre de colagen de tipurile I și II. S. Nehrer și colab. (1997) au comparat funcționarea condrocitelor canine în matrici polimerice poroase de colagen-proteoglican care conțin colageni de diferite tipuri. Aceștia au descoperit diferențe importante în morfologia funcției biosintetice a condrocitelor cultivate în matrici de colagen care conțin colagen de tipurile I și II. Celulele dintr-o matrice de colagen de tip II și-au păstrat forma sferică, în timp ce în colagenul de tip I au avut o morfologie asemănătoare fibroblastelor. Mai mult, într-o matrice de colagen de tip II, condrocitele au produs o cantitate mai mare de glicozaminoglicani. J. van Susante și colab. (1995) au comparat proprietățile condrocitelor cultivate în gel de alginat și colagen (tip I). Autorii au constatat o creștere semnificativă a numărului de celule din gelul de colagen, dar din a 6-a zi de cultivare celulele și-au pierdut fenotipul caracteristic, transformându-se în celule asemănătoare fibroblastelor. În gelul de alginat s-a observat o scădere a numărului de celule, dar condrocitele și-au păstrat fenotipul normal. În gelul de colagen, numărul de proteoglicani per celulă a fost semnificativ mai mare decât în alginat, dar în gel s-a observat o scădere a sintezei elementelor matriceale, începând cu a 6-a zi de cultivare, în timp ce în alginat sinteza a continuat să crească.

Matricea solidă tridimensională de fibrină este o substanță naturală care susține condrocitele suspendate în ea într-un fenotip diferențiat. Matricea tridimensională de fibrină poate fi utilizată și ca purtător în transplantul de condrocite. Avantajele fibrinei sunt absența citotoxicității, capacitatea de a umple spațiul și capacitatea adezivă. Studiile histologice și biochimice, autoradiografia și microscopia electronică au arătat că condrocitele din gelul de fibrină își păstrează morfologia, proliferează și produc matrice chiar și după 2 săptămâni de cultivare. Cu toate acestea, G. Homminga și colab. (1993) au raportat că dezintegrarea fibrinei începe după 3 zile de cultivare, iar dediferențierea condrocitelor progresează.

Suspensia condrocitelor în ECM artificială (sintetică)

Implanturile de cartilaj pentru chirurgie reconstructivă sau ortopedică pot fi obținute prin creșterea in vitro a condrocitelor izolate într-o matrice sintetică biocompatibilă.

Condrocitele cultivate în acid poliglicolic proliferează și își mențin morfologia și fenotipul normale timp de 8 săptămâni. Complexul condrocit-acid poliglicolic este format din celule, glicozaminoglicani, colageni și are o capsulă externă de colagen. Cu toate acestea, astfel de implanturi conțin două tipuri de molecule de colagen - I și II. Implanturile provenite de la condrocite dediferențiate printr-o serie de pasaje au o cantitate mai mare de glicozaminoglicani și colageni decât implanturile provenite de la condrocite în principal nediferențiate.

L. Freed și colab. (1993b) au comparat comportamentul culturilor de condrocite umane și bovine în acid poliglicolic fibros (FPGA) și acid polilactic poros (PPLA). După 6-8 săptămâni de cultivare a condrocitelor bovine în FPGA sau PPLA, autorii au observat proliferarea celulară și regenerarea matricei cartilajului. În FPGA, condrocitele aveau o formă sferică și erau situate în lacune înconjurate de o matrice cartilajului. După 8 săptămâni de cultivare in vitro, țesutul regenerat conținea până la 50% substanță uscată (4% masă celulară, 15% glicozaminoglicani și 31% colagen). În PPLA, celulele aveau o formă fusiformă și o cantitate mică de glicozaminoglicani și colagen. În FPGA, creșterea celulară a fost de 2 ori mai intensă decât în PPLA. In vivo, condrocitele cultivate în VPGK și PPLC au produs țesut histologic similar cartilajului în decurs de 1-6 luni. Implanturile conțineau glicozaminoglicani, colagen de tip I și II.

Condrocitele fetale bovine au fost cultivate în polietilenă poroasă de înaltă densitate, hidrofobă și hidrofilă. După 7 zile de incubare în ambele substraturi, celulele și-au păstrat forma sferică și conțineau în principal colagen de tip II. După 21 de zile de cultivare, s-a constatat că matricea hidrofilă conține mai mult colagen de tip II decât matricea hidrofobă.

Țesutul cartilaginos poate fi obținut și prin cultivare în monostrat pe filtre Millicell-CM. Pre-acoperirea filtrelor cu colagen este necesară pentru atașarea condroitinelor. Examinarea histologică a culturii demonstrează acumularea de condrocite în ECM care conține proteoglicani și colagen de tip II. Colagenul de tip I nu a fost detectat într-o astfel de cultură. Condrocitele din țesutul cartilaginos obținut au formă sferică, dar la suprafața țesutului sunt oarecum aplatizate. Grosimea țesutului nou format a crescut în timp și a depins de densitatea inițială a monostratului celular. În condiții optime de cultivare, grosimea țesutului cartilaginos a ajuns la 110 μm, organizarea celulelor și a colagenului său în straturi superficiale și profunde este similară cu cea a cartilajului articular. ECM conține de aproximativ 3 ori mai mult colagen și proteoglicani. După 2 săptămâni de cultivare, s-a observat acumularea de matrice, permițând extragerea țesutului din filtru și utilizarea acestuia pentru transplant.

Sims și colab. (1996) au studiat cultivarea condrocitelor în gel de oxid de polietilenă, o matrice polimerică încapsulată ce permite transferul unui număr mare de celule prin injecție. La șase săptămâni după injectarea în țesutul subcutanat al șoarecilor atimici, s-a format cartilaj nou, care a fost caracterizat morfologic printr-o opalescență albă similară cartilajului hialin. Datele histologice și biochimice au indicat prezența condrocitelor cu proliferare activă, producătoare de ECM.

Explantare

Explantarea țesutului cartilaginos este utilizată pentru a studia procesele de anabolism și catabolism din acesta, menținerea homeostaziei, resorbție și reparare. Condrocitele din explantele de cartilaj mențin un fenotip normal și o compoziție a matricii extracelulare (ECM) similară cu cele din cartilajul articular in vivo. După 5 zile de cultivare în prezența serului, se atinge un nivel constant de sinteză și procese naturale de degradare. Resorbția țesuturilor poate fi accelerată în cultura principală și în cultură prin adăugarea de ser folosind o serie de agenți, cum ar fi IL-IB, TNF-a, lipopolizaharide bacteriene, derivați ai acidului retinoic sau radicali de oxigen activ. Pentru a studia repararea cartilajului, deteriorarea acestuia este indusă de mediatori inflamatori solubili (H2O2, _IL 1, TNF-a) sau prin ruptura fizică a matricei.

Metoda de cultură organotipică este un model pentru studiile in vitro ale efectelor factorilor externi izolați asupra condrocitelor și matricei înconjurătoare. In vivo, condrocitele sunt localizate rar în ECM și nu intră în contact între ele. Cultura explantului de cartilaj articular păstrează această organizare structurală, precum și interacțiunile specifice dintre condrocite și mediul extracelular înconjurător. Acest model este, de asemenea, utilizat pentru a studia efectele stresului mecanic, agenților farmacologici, factorilor de creștere, citokinelor și hormonilor asupra metabolismului cartilajului.

Un alt avantaj al explantării țesutului cartilaginos este absența deteriorării condrocitelor sub acțiunea enzimelor proteolitice sau a factorilor mecanici, ceea ce este inevitabil la izolarea celulelor. Receptorii și alte proteine și glicoproteine membranare sunt protejate de factorii nocivi.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Cultura Chondron

Condronul este o unitate structurală, funcțională și metabolică a cartilajului articular, constând dintr-un condrocit, matricea sa pericelulară și o capsulă filamentoasă compactă și responsabilă de homeostazia matricei. Condronii sunt extrași mecanic din cartilaj și colectați folosind mai multe omogenizări succesive la viteză redusă. Condronii izolați din zone cu diferite adâncimi ale cartilajului pot fi împărțiți în patru categorii: condron singular, condroni perechi, condroni multipli (trei sau mai mulți) aranjați liniar (coloane de condroni) și grupuri de condroni.

Condronii singulari se găsesc de obicei în straturile medii ale cartilajului intact, condronii perechi se găsesc la limita straturilor medii și profunde, condronii multipli dispuși liniar fiind tipici straturilor profunde ale cartilajului intact. În cele din urmă, grupurile de condroni constau din grupuri organizate aleatoriu de condroni singulari și perechi, care își păstrează o stare agregată după omogenizare. Grupurile de condroni sunt fragmente mari de cartilaj, care conțin de obicei mai mulți condroni și fibrile de colagen dispuse radial, adică o organizare tipică, caracteristică straturilor profunde ale matricei. Condronii sunt imobilizați în agaroză transparentă, ceea ce permite studii ale structurii, compoziției moleculare și activității lor metabolice. Sistemul condron-agaroză este considerat un micromodel al cartilajului, care diferă de sistemul tradițional condrocit-agaroză prin faptul că micromediul natural este păstrat și nu este nevoie să fie sintetizat și asamblat. Cultura de condroni este un model pentru studierea interacțiunilor celulelor și matricei în cartilajul articular în condiții normale și patologice.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Cultura condrocitelor nemuritoare

ADN-ul recombinant sau virusurile care conțin oncogene, capabile să facă o celulă „nemuritoare”, sunt utilizate pentru a crea linii celulare permanente. Condrocitele nemuritoare au capacitatea de a prolifera la nesfârșit, menținând în același timp un fenotip stabil. F. Mallein-Gerin și colab. (1995) au arătat că oncogena SV40T induce proliferarea condrocitelor de șoarece, care continuă să exprime stabil colagenul de tipuri II, IX și XI, precum și agrecanul articular și proteina de legare. Cu toate acestea, o astfel de linie celulară dobândește capacitatea de a sintetiza colagenul de tip I atunci când este cultivată într-o cultură monostrat sau într-un gel de agaroză.

W. Horton și colab. (1988) au descris o linie de celule nemuritoare cu un nivel scăzut de expresie a ARNm-ului de colagen de tip II. Aceste celule au fost obținute prin transformarea lor cu un retrovirus de șoarece care conține oncogenele I-myc și y-ra. Acest tip de celule reprezintă un model unic pentru studierea interacțiunilor matricei articulare în absența colagenului de tip II, precum și reglarea sintezei colagenului de tip II.

Cultura condropriților cu gene mutate sau șterse este un model convenabil pentru studierea funcției lor fiziologice. Acest model este potrivit în special pentru studierea rolului unor molecule specifice în organizarea matricei cartilajului sau pentru investigarea efectelor diferiților factori de reglare asupra metabolismului cartilajului. Condrocitele cu o genă ștearsă pentru colagenul de tip IX sintetizează fibrile de colagen care sunt mai late decât în mod normal, indicând faptul că colagenul de tip IX reglează diametrul fibrilelor. După cum s-a menționat în Capitolul 1, o mutație a genei COLAI care codifică colagenul de tip II a fost descoperită recent în familii cu osteoartrită generalizată primară. Pentru a studia efectul colagenului de tip II mutant asupra matricei articulare, R. Dharmrvaram și colab. (1997) au transfectat (infectat cu acid nucleic străin) COL ₂ AI defectiv (arginina din poziția 519 este înlocuită cu cisteină) în condrocite fetale umane in vitro.

Sistem de cocultură. În articulație, cartilajul interacționează cu alte tipuri de celule conținute în membrana sinovială, lichidul sinovial, ligamente și osul subcondral. Metabolismul condrocitelor poate fi afectat de diverși factori solubili sintetizați de celulele enumerate. Astfel, în artrită, cartilajul articular este distrus de enzimele proteolitice și radicalii liberi produși de celulele sinoviale. Prin urmare, au fost dezvoltate modele pentru a studia interacțiunile complexe dintre cartilaj și țesuturile înconjurătoare, care se numesc coculturi.

S. Lacombe-Gleise și colab. (1995) au cultivat condrocite și osteoblaste de iepure într-un sistem de cocultură (COSTAR) în care celulele au fost separate printr-o membrană microporoasă (0,4 μm) permițând schimbul între cele două tipuri de celule fără niciun contact direct. Acest studiu a demonstrat capacitatea osteoblastelor de a stimula creșterea condrocitelor prin intermediul unor mediatori solubili.

AM Malfait și coautorii (1994) au studiat relația dintre monocitele din sângele periferic și condrocite. Acest model este convenabil pentru studierea proceselor mediate de citokine în artropatiile inflamatorii (artrita reumatoidă, spondilartritele seronegative etc.). Autorii modelului au separat celulele cu o membrană de legare a proteinelor cu pori de 0,4 μm în diametru. Studiul a arătat că monocitele stimulate cu lipopolisaharide au produs IL-1 și TNF-α, care au inhibat sinteza agrecanului de către condrocite și au contribuit la degradarea agregatelor de agrecan deja sintetizate.

K. Tada și colab. (1994) au creat un model de cocultură în care celulele endoteliale într-un gel de colagen (tip I) au fost plasate într-o cameră interioară separată de camera exterioară, în care au fost plasate condrocite printr-un filtru cu o dimensiune a porilor de 0,4 μm. Într-o stare de izolare completă față de camera exterioară, celulele endoteliale umane au format tuburi într-un gel de colagen în prezența EGF sau TGF-a. Când ambele tipuri de celule au fost cultivate simultan, formarea tuburilor dependente de TGF-a de către celulele endoteliale a fost inhibată. Inhibarea acestui proces de către condrocite a fost parțial eliminată de anticorpii anti-TGF-beta. Se poate presupune că TGF-beta produs de condrocite inhibă vascularizația cartilajului în sine.

S. Groot și colab. (1994) au cultivat simultan condrocite din zonele hipertrofice și proliferative ale osului unui făt de șoarece în vârstă de 16 zile cu fragmente de țesut cerebral. După 4 zile de cultivare, s-a observat transdiferențierea condrocitelor în osteoblaste și începutul formării osteoidului. După 11 zile de cultivare, o parte din cartilaj a fost înlocuită cu țesut osos, iar matricea osoasă a fost parțial calcificată. Unele neuropeptide și neurotransmițători produși de țesutul cerebral afectează metabolismul osteoblastelor sau au receptori pentru acestea. Printre acestea se numără norepinefrina, peptida intestinală vasoactivă, peptida legată de gena calcitoninei, substanța P și somatostatina. Fragmente de țesut cerebral cultivate împreună cu condrocite pot produce unii dintre factorii enumerați, capabili să inducă procesul de transdiferențiere a condrocitelor în osteoblaste.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Influența factorilor externi asupra culturii condrocitelor

Influența presiunii oxigenului asupra metabolismului condrocitelor

În majoritatea cazurilor, culturile de condrocite se dezvoltă în condiții de tensiune atmosferică a oxigenului. Cu toate acestea, este bine cunoscut faptul că in vivo condrocitele există în condiții hipoxice, iar tensiunea oxigenului variază în diverse condiții patologice. În timpul procesului de maturare, se observă modificări semnificative în alimentarea cu sânge a epifizelor. Deoarece vascularizația variază în diferite zone ale plăcii de creștere, și tensiunea oxigenului din acestea variază. C. Brighton și R. Heppenstall (1971) au demonstrat că în placa tibială a iepurilor, tensiunea oxigenului în zona hipertrofică este mai mică decât în cartilajul înconjurător. Măsurătorile unor parametri metabolici au arătat că condrocitele sunt capabile să răspundă rapid la modificările locale ale concentrației de oxigen. În primul rând, la o tensiune scăzută a oxigenului, consumul acestuia de către condrocite scade. Odată cu scăderea tensiunii oxigenului de la 21 la 0,04%, utilizarea glucozei crește, activitatea enzimelor glicolitice și sinteza acidului lactic cresc. Chiar și la o tensiune scăzută a oxigenului, cantitatea absolută de ATP, ADP și AMP rămâne stabilă. Aceste date indică faptul că metabolismul condrocitelor vizează conservarea maximă a energiei. Cu toate acestea, activitatea sintetică și, prin urmare, procesele de reparare, se modifică în condiții hipoxice.

Tensiunea ridicată a oxigenului afectează, de asemenea, metabolismul condrocitelor, provocând o scădere a sintezei proteoglicanilor și ADN-ului și degradarea matricei cartilajului. Aceste efecte sunt de obicei însoțite de producerea de radicali liberi de oxigen.

Influența concentrației de ioni și a presiunii osmotice a mediului asupra funcției condrocitelor

În cartilajul nativ, concentrația ionilor diferă semnificativ de cea din alte țesuturi: conținutul de sodiu în mediul extracelular este de 250-350 mmol, iar osmolaritatea sa este de 350-450 mosmol. Când condrocitele sunt izolate din ECM și incubate în medii standard (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), osmolaritatea este de 250-280,7 mosmol), mediul din jurul celulelor se schimbă dramatic. În plus, concentrația de calciu și potasiu în mediile standard este semnificativ mai mică decât în țesutul nativ, iar concentrația de anioni este semnificativ mai mare.

Adăugarea de zaharoză în mediu crește osmolaritatea acestuia și induce o creștere intracelulară tranzitorie a concentrației de anioni de H ⁺ și calciu în citosol. Astfel de modificări intracelulare pot afecta procesele de diferențiere a condrocitelor și activitatea lor metabolică. J. Urban și colab. (1993) au descoperit că încorporarea de ³⁵⁸ -sulfat și ^3H -prolină de către condrocitele izolate incubate în DMEM standard timp de 2-4 ore a fost de doar 10% din cea din țesutul nativ. Intensitatea sintezei a atins un maxim la o osmolaritate a mediului extracelular de 350-400 mosmol atât în condrocitele proaspăt izolate, cât și în explantele de țesut cartilaginos. Mai mult, volumul condrocitelor a crescut cu 30-40% după plasarea celulelor izolate în DMEM standard cu osmolaritatea specificată. Totuși, atunci când se cultivă condrocite în condiții de osmolaritate non-fiziologică timp de 12-16 ore, celulele se adaptează la noile condiții, reducând intensitatea biosintezei proporțional cu schimbarea osmolarității mediului extracelular.

P. Borgetti și colab. (1995) au studiat efectul osmolarității mediului extracelular asupra creșterii, morfologiei și biosintezei condrocitelor porcine. Autorii au demonstrat caracteristici biochimice și morfologice similare ale condrocitelor cultivate în medii cu osmolaritate de 0,28 și 0,38 mosmol. La o osmolaritate medie de 0,48 mosmol, s-a observat o scădere a proliferării celulare și a sintezei proteinelor în primele 4-6 ore de cultivare, dar acești parametri s-au revenit ulterior și au atins în cele din urmă valorile de control. Când condrocitele au fost cultivate într-un mediu cu o osmolaritate de 0,58 mosmol, celulele au pierdut capacitatea de a menține intensitatea fiziologică a proceselor proliferative, iar după 6 zile numărul de condrocite a fost redus semnificativ. La o osmolaritate medie de 0,58 mosmol, s-a observat o inhibare profundă a sintezei proteinelor. În plus, atunci când sunt cultivate în medii cu o osmolaritate de 0,28-0,38 mOsm, condrocitele își păstrează fenotipul fiziologic; la o osmolaritate mai mare (0,48-0,58 mOsm), apar modificări semnificative ale morfologiei celulare, care se manifestă prin pierderea fenotipului caracteristic, transformarea condrocitelor în celule asemănătoare fibroblastelor și pierderea capacității celulelor de a asambla proteoglicani matriceali. Rezultatele acestui studiu indică capacitatea condrocitelor de a răspunde la fluctuații limitate ale osmolarității mediului extracelular.

Modificările concentrației altor ioni pot afecta, de asemenea, procesele de biosinteză din condrocite. Astfel, gradul de încorporare a ^35S (sulfatului) crește la jumătate odată cu creșterea concentrației de ioni de potasiu de la 5 mmol (concentrația în mediul standard DM EM) la 10 mmol (concentrația în ECM in vivo). Concentrațiile de calciu sub 0,5 mmol au promovat producția de colagen de către condrocitele bovine mature, în timp ce o concentrație de 1-2 mmol (corespunzătoare concentrației din mediul standard DM EM) a cauzat o scădere semnificativă a sintezei de colagen. O creștere moderată a biosintezei a fost observată la niveluri ridicate de calciu (2-10 mmol). Diverși cationi participă la atașarea condrocitelor la proteinele ECM. Astfel, ionii de magneziu și mangan asigură atașarea la fibronectină și colagenul de tip II, în timp ce ionii de calciu nu participă la atașarea condrocitelor la proteine. Astfel, rezultatele studiilor descrise indică influența modificărilor ionilor extracelulari de potasiu, sodiu, calciu și a osmolarității mediului asupra funcției biosintetice a condrocitelor incubate în medii standard.

Efectul stresului mecanic asupra metabolismului condrocitelor

Imobilizarea articulară provoacă atrofie reversibilă a cartilajului, ceea ce indică necesitatea stimulilor mecanici pentru procesele metabolice normale din ECM. În majoritatea cazurilor, modelele de cultură celulară utilizate există sub presiune atmosferică normală. M. Wright și colab. (1996) au arătat că mediul mecanic afectează metabolismul condrocitelor, răspunsul celular depinzând de intensitatea și frecvența încărcării compresive. Experimentele cu încărcare pe explante de cartilaj articular intact in vitro au demonstrat o scădere a sintezei proteinelor și proteoglicanilor sub acțiunea încărcării statice, în timp ce încărcarea dinamică stimulează aceste procese. Mecanismele exacte ale efectului încărcării mecanice asupra cartilajului sunt complexe și sunt probabil asociate cu deformarea celulară, presiunea hidrostatică, presiunea osmotică, potențialul electric și receptorii celulari de suprafață pentru moleculele matriceale. Pentru a studia efectul fiecăruia dintre acești parametri, este necesar să se creeze un sistem în care un parametru să poată fi variat independent. De exemplu, cultura explantelor nu este potrivită pentru studierea deformării celulare, dar poate fi utilizată pentru a studia efectul general al presiunii asupra activității metabolice a condrocitelor. Compresia cartilajului duce la deformarea celulară și este însoțită și de apariția unui gradient de presiune hidrostatică, a unui potențial electric, a fluxului de fluid și a unor modificări ale parametrilor fizico-chimici, cum ar fi conținutul de apă din matrice, densitatea sarcinii electrice și nivelul presiunii osmotice. Deformarea celulară poate fi studiată folosind condrocite izolate imersate în gel de agaroză sau colagen.

Au fost dezvoltate mai multe sisteme pentru a studia efectul stimulării mecanice asupra culturii de condrocite. Unii cercetători utilizează sisteme în care presiunea este aplicată culturii celulare prin faza gazoasă. Astfel, JP Veldhuijzen și colab. (1979), utilizând o presiune cu 13 kPa peste cea atmosferică, cu o frecvență joasă (0,3 Hz) timp de 15 minute, au observat o creștere a sintezei de cAMP și proteoglicani și o scădere a sintezei ADN-ului. R. Smith și colab. (1996) au arătat că expunerea intermitentă a unei culturi de condrocite bovine primare la presiune hidrostatică (10 MPa) cu o frecvență de 1 Hz timp de 4 ore a cauzat o creștere a sintezei de agrecan și colagen de tip II, în timp ce presiunea constantă nu a afectat aceste procese. Folosind un sistem similar, Wright și colab. (1996) au raportat că presiunea ciclică asupra culturii celulare este asociată cu hiperpolarizarea membranei celulare a condrocitelor și activarea canalelor de potasiu dependente de Ca2 ⁺. Astfel, efectele presiunii ciclice sunt mediate de canalele ionice activate prin întindere din membrana condrocitelor. Răspunsul condrocitelor la presiunea hidrostatică depinde de condițiile de cultură celulară și de frecvența sarcinii aplicate. Astfel, presiunea hidrostatică ciclică (5 MPa) scade încorporarea sulfatului în monostratul condrocitelor la o frecvență de 0,05, 0,25 și 0,5 Hz, în timp ce la o frecvență mai mare de 0,5 Hz, încorporarea sulfatului în explantul cartilajului crește.

M. Bushmann și colab. (1992) au raportat că condrocitele din gelurile de agaroză modifică biosinteza ca răspuns la încărcarea mecanică statică și dinamică, în același mod ca și organul intact cultivat. Autorii au descoperit că încărcarea mecanică generează un stimul hiperosmotic cu o scădere ulterioară a pH-ului în condrocite.

Efectul întinderii mecanice poate fi studiat pe o cultură celulară imersată într-un gel. Forța de întindere poate fi creată folosind un vid controlat de computer. Atunci când sistemul se află sub un anumit grad de vid, fundul plăcii Petri cu cultura celulară este extins cu o cantitate cunoscută, deformarea fiind maximă la marginile fundului plăcii și minimă în centru. Întinderea este transmisă și condrocitelor cultivate în placa Petri. Folosind această metodă, K. Holm-vall și colab. (1995) au arătat că în celulele de condrosarcom cultivate într-un gel de colagen (tip II), expresia ARNm a integrinei 2- este crescută. O _{integrină2β} este _capabilă să se lege de colagenul de tip II. Este considerată un mecanoreceptor, deoarece interacționează cu proteinele care leagă actină, conectând astfel ECM și citoscheletul.

Efectul pH-ului asupra metabolismului condrocitelor

PH-ul fluidului interstițial al ECM-ului țesutului cartilajului este mai acid decât în alte țesuturi. A. Maroudas (1980) a determinat pH-ul matricei cartilajului articular la 6,9. B. Diamant și colab. (1966) au găsit un pH de 5,5 în condiții patologice. Se știe că condrocitele trăiesc la PO2 scăzut, ceea ce indică rolul important al glicolizei (95% din metabolismul total al glucozei) în metabolismul acestor celule; glicoliza este însoțită de producerea unei cantități mari de acid lactic.

Pe lângă acidificarea mediului prin produșii glicolizei, componentele matricei în sine sunt de o mare importanță. Cantitatea mare de sarcină negativă fixă de pe proteoglicani modifică compoziția ionică extracelulară: se observă o concentrație mare de cationi liberi (de exemplu, H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) și o concentrație scăzută de anioni (de exemplu, O2, HCO3). În plus, sub influența încărcării mecanice, apa este expulzată din ECM, ceea ce duce la o creștere a concentrației de sarcini negative fixe și la atragerea mai multor cationi în matrice. Aceasta este însoțită de o scădere a pH-ului mediului extracelular, ceea ce afectează pH-ul intracelular, modificând astfel metabolismul condrocitelor. R. Wilkin și A. Hall (1995) au studiat efectul pH-ului mediului extracelular și intracelular asupra biosintezei matricei de către condrocitele bovine izolate. Aceștia au observat o modificare duală a sintezei matricei cu o scădere a pH-ului. O ușoară scădere a pH-ului (7,4de 35SO4 și ^{3H -prolină în condrocite,}_în timp ce acidificarea mai profundă a mediului (pH<7,1) a inhibat sinteza cu 75% comparativ cu controlul. Crearea unui pH scăzut (6,65) folosind ioni de amoniu a cauzat o scădere a sintezei matricei cu doar 20%. Rezultatele obținute indică faptul că modificarea pH-ului mediului extracelular de sinteză a matricei nu poate fi explicată doar prin modificările pH-ului mediului intracelular. Mai mult, condrocitele au capacitatea de a regla pH-ul intracelular folosind schimbătorul de Na ⁺, H ^{+, transportorul de Cl-} NSO3 dependent de Ka ⁺ și H ⁺ /ATPaza.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Influența compoziției mediului de cultură asupra metabolismului condrocitelor

Mediul pentru cultivarea condrocitelor trebuie să corespundă condițiilor experimentale. În ultimii ani, serul de vițel a fost utilizat pentru a optimiza condițiile de cultură. Cu toate acestea, atunci când se utilizează ser, trebuie luate în considerare o serie de aspecte importante:

• creșterea exterioară a celulelor de la periferia țesutului în culturile de organe,
• variabilitatea compoziției serurilor din diferite serii,
• prezența unor componente necunoscute în acestea,
• risc crescut de interferențe și artefacte la studierea influenței diferiților factori biologici asupra activității metabolice a celulelor.

Un exemplu în acest ultim sens este un studiu al efectului EGF asupra condrocitelor cartilajului la șobolani. EGF a stimulat încorporarea ^3H -timidinei și o creștere a conținutului de ADN în cultură. Acest efect a fost mai pronunțat la concentrații serice scăzute (<1%), dar la concentrații mari (>7,5%) efectul a dispărut.

Este bine cunoscut faptul că nivelurile de sinteză și degradare în DMEM suplimentat cu ser de vițel sunt semnificativ crescute în comparație cu condițiile in vivo. Diferențele dintre metabolismul in vivo și in vitro se pot datora diferențelor dintre lichidul sinovial și mediul în care sunt cultivate celulele. Lee și colab. (1997) au cultivat condrocite bovine tinere în agaroză folosind un mediu nutritiv care conținea DMEM suplimentat cu 20% ser de vițel și o cantitate mare de lichid sinovial alogen normal. Prezența lichidului sinovial în mediu a indus o creștere a cantității de proteoglicani, până la 80% din cantitatea totală de lichid sinovial. Aceste rezultate indică faptul că lichidul sinovial în cultură induce un nivel de metabolism similar cu cel in vivo, cu un nivel ridicat de sinteză a glicozaminoglicanilor și un nivel scăzut de diviziune celulară.

G. Verbruggen și colab. (1995) au arătat că sinteza de ³⁵ S-arrpeKaHa de către condrocitele umane cultivate în agaroză în DMEM fără ser a reprezentat 20-30% din nivelul de sinteză observat în DMEM suplimentat cu 10% ser de vițel. Autorii au determinat măsura în care IGF-1, IGF-2, TGF-R sau insulina au restabilit producția de agrecan în mediu fără ser. Autorii au concluzionat că 100 ng/ml insulină, IGF-1 sau IGF-2 au restabilit parțial sinteza de agrecan la 39-53% din nivelul de control. Nu s-a observat sinergism sau cumulare cu o combinație a factorilor enumerați. În același timp, 10 ng/ml TGF-R în prezența a 100 ng/ml insulină a stimulat sinteza de agrecan la 90% sau mai mult din nivelul de referință. În cele din urmă, transferina serică umană, singură sau în combinație cu insulina, nu a afectat sinteza de agrecan. Când serul de vițel a fost înlocuit cu albumină serică bovină, conținutul de agregate de agrecan a scăzut semnificativ. Îmbogățirea mediului de cultură cu insulină, IGF sau TGF-R a restabilit parțial capacitatea celulelor de a produce agregate de agrecan. Mai mult, IGF-1 și insulina sunt capabile să mențină homeostazia în culturile celulare. După 40 de zile de cultivare într-un mediu îmbogățit cu 10-20 ng/ml IGF-1, sinteza proteoglicanilor a fost menținută la același nivel sau chiar mai mare în comparație cu mediul care conținea 20% ser de vițel. Procesele catabolice au decurs mai lent în mediul îmbogățit cu IGF-1 decât în mediul îmbogățit cu soluție de albumină 0,1%, dar ceva mai rapid în mediul îmbogățit cu 20% ser. În culturile cu viață lungă, 20 ng/ml IGF-1 menține o stare stabilă a celulelor.

D. Lee și colab. (1993) au comparat efectul compoziției mediului de cultură (DMEM, DMEM+20% ser de vițel, DMEM+20 ng/ml IGF-1) asupra sintezei ADN-ului într-o cultură de explant de țesut cartilaginos, o cultură în monostrat și în suspensie de agaroză. La cultivarea în agaroză în prezența serului, autorii au observat o tendință a condrocitelor de a se grupa în clustere mari. Celulele cultivate fără ser sau cu IGF-1 au păstrat o formă rotundă în agaroză, fiind colectate în grupuri mici, dar nu au format agregate mari. Într-un monostrat, sinteza ADN-ului a fost semnificativ mai mare în mediul care conține ser decât în mediul îmbogățit cu IGF-1; sinteza ADN-ului în acesta din urmă a fost semnificativ mai mare decât în mediul neîmbogățit. Nu s-au constatat diferențe în sinteza ADN-ului atunci când condrocitele au fost cultivate în suspensie de agaroză într-un mediu neîmbogățit și într-un mediu cu IGF-1. În același timp, cultivarea suspensiilor de condrocite în agaroză într-un mediu îmbogățit cu ser a fost însoțită de o încorporare crescută a radionucleotidului ³ H-timidină în comparație cu alte medii.

Vitamina C este necesară pentru activarea enzimelor implicate în formarea unei structuri elicoidale stabile a fibrilelor de colagen. Condrocitele cu deficit de acid ascorbic sintetizează precursori de colagen neelicoidal subhidroxilați, care sunt secretați lent. Administrarea de acid ascorbic (50 μg/ml) determină hidroxilarea colagenului de tip II și IX și secreția acestuia în cantități normale. Adăugarea de vitamina C nu a afectat nivelul sintezei proteoglicanilor. Prin urmare, secreția de colagen este reglată independent de secreția de proteoglicani.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]